酵母雙雜交（Y2H,yeast 2 hybrid）用于蛋白-蛋白相互作用研究。這項(xiàng)技術(shù)基于1989年Fields和Song[1]的研究，迄今已被引用超過28,000次。 在Matchmaker Gold Yeast Two Hybrid System中，目的基因與酵母GAL4轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-BD)融合表達(dá)作為Bait蛋白。Prey 蛋白由目的基因與GAL4轉(zhuǎn)錄因子的AD融合表達(dá)， Bait融合蛋白自身不能激活轉(zhuǎn)錄但是可以與位于4個報(bào)告基因上游的GAL4應(yīng)答啟動子結(jié)合?；プ鞯鞍?，通常是文庫形式，與酵母GAL4的轉(zhuǎn)錄激活域（AD）融合表達(dá)，作為Prey蛋白。當(dāng)Prey蛋白與Bait蛋白有相互作用時(shí)，GAL4重構(gòu)從而可以激活表達(dá)1個或多個報(bào)告基因。 ● [1]. Fields,S. and Song, O.(1989) Nature 340(6230):245-247
酵母可以提供一個體內(nèi)真核系統(tǒng)，同時(shí)又兼具原核細(xì)菌系統(tǒng)的可操作性強(qiáng)、簡單易用的優(yōu)點(diǎn)?；谝韵聨c(diǎn)，S. cerevisiae成為目前常用的酵母雙雜技術(shù)的宿主菌：在酵母體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)可以正確的折疊；提供中性pH內(nèi)部環(huán)境；可以形成二硫鍵和其他真核系統(tǒng)共有的翻譯后修飾。這些特點(diǎn)對于維持天然蛋白結(jié)構(gòu)獲得真實(shí)的蛋白互作關(guān)系至關(guān)重要。同時(shí)，酵母可操作性強(qiáng)，并且已進(jìn)行全基因組測序。利用同源重組可以很方便地直接在酵母中構(gòu)建文庫。
首先，要選擇合適的bait蛋白，有些bait蛋白由于有自激活活性會產(chǎn)生很多假陽性。其次，要選擇潛在互作蛋白代表性強(qiáng)的文庫，如特異組織文庫。同時(shí)，還要選擇合適的篩選強(qiáng)度。如果篩選強(qiáng)度太高，將獲得很少的陽性，如果篩選強(qiáng)度太低，會導(dǎo)致假陽性率過高。
酵母雙雜交采用多個報(bào)告基因可以極大地降低假陽性，可以從以下幾個問題回答：
①什么是假陰性和假陽性？
■假陰性是指目的蛋白在天然條件下可以與另一個蛋白互作，但是采用酵母雙雜系統(tǒng)驗(yàn)證時(shí)為陰性。
■假陽性是指利用酵母雜交篩選獲得的與bait有互作的prey蛋白，經(jīng)過生理學(xué)方法驗(yàn)證與bait蛋白沒有互作。
假陽性是由于蛋白與GAL4 BD域、DNA或DNA相關(guān)蛋白互作引起。
②假陽性與背景生長有什么區(qū)別？
■ 酵母雙雜系統(tǒng)只采用HIS3營養(yǎng)報(bào)告基因篩選蛋白-蛋白互作時(shí)，經(jīng)常會獲得大量的背景克隆和假陽性。
■ 背景克隆是由于營養(yǎng)報(bào)告基因泄露表達(dá)或涂板密度過高引起的。而假陽性是由于prey蛋白未與bait蛋白
互作即可識別和結(jié)合報(bào)告基因上游序列引起的。
■ Matchmaker Gold系統(tǒng)采用新型的、穩(wěn)定的酵母抗生素AbA，可以有效殺死非抗性克隆，從而極大地降低
了背景克隆的生長。同時(shí)，Matchmaker Gold系統(tǒng)有效地減少了假陽性，這是由于任何prey蛋白單獨(dú)結(jié)合
引起假陽性都需要識別3個不同的啟動子，激活4個報(bào)告基因的表達(dá)。Matchmaker Gold系統(tǒng)是唯一采用
3個不同啟動子控制4個報(bào)告基因表達(dá)的雙雜交系統(tǒng)。
· 通常來講，bait不能帶有跨膜結(jié)構(gòu)域。
· bait和prey的互作不能依賴于糖基化，這是由于酵母翻譯后修飾不包括糖基化。
· bait與GAL4 BD域融合表達(dá)后可以正確的折疊。
· bait不能激活酵母中報(bào)告基因的表達(dá)（即不能有自激活活性）。
如果bait是真核轉(zhuǎn)錄因子，有可能在不需要與prey互作的情況下就可以激活酵母報(bào)告基因的表達(dá)，這就是自激活，可以通過檢測bait菌株是否可以在含有AbA的選擇性培養(yǎng)基上生長來進(jìn)行驗(yàn)證（參考Matchmaker Gold操作手冊）。如果你的bait可以激活報(bào)告基因，你依然可以進(jìn)行酵母雙雜交，不過首先需要去除轉(zhuǎn)錄激活域。例如，Matchmaker Gold系統(tǒng)中采用的陽性對照鼠類p53片段，去掉了N端可能含有轉(zhuǎn)錄激活域的71個氨基酸。
由于bait可能包含可以招募酵母內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子的基序或結(jié)構(gòu)域，也可能是bait可以直接與RNA聚合酶II形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物啟動轉(zhuǎn)錄。疏水性或雙親螺旋可能會導(dǎo)致自激活[1-2]。酸性殘基被認(rèn)為與轉(zhuǎn)錄因子自激活區(qū)域相關(guān)[1,3-4]；但是并不是所有的酸性蛋白都會激活轉(zhuǎn)錄。
● [1]. Ruden, D. M. (1992) Chromosoma 101(5?6):342-348.
● [2]. Abedi, M. et al. (2001) BMC Mol. Biol. 2:10.
● [3]. Ma, J. and Ptashne, M. (1987) Cell 51(1):113?119.
● [4]. Ruden, D. M. et al. (1991) Nature 350(6315):250?252.
可以，但是由于轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，所以互作的蛋白需定位到細(xì)胞核內(nèi)才能發(fā)揮作用。即bait-prey的相互作用必須在細(xì)胞核內(nèi)才能啟動酵母基因組上報(bào)告基因的表達(dá)。只要蛋白能夠正確折疊并定位到核內(nèi)（Matchmaker 雙雜交載體中都含有核定位信號），就可以檢測bait蛋白與文庫蛋白的互作。通常建議去掉bait蛋白的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。
有很多用于膜蛋白酵母雙雜研究的文獻(xiàn)可供參考：
● Hopkinson, S.B. & Jones, J.C. (2000) Mol. Biol. Cell. 11(1):277–286.
● Traweger, A. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277(12):10201–10208.
● Tian, X.Y. et al. (2001) Reproduction. 121(6):873–880.
● Daniel, J.M. & Reynolds, A.B. (1999) Mol. Cell. Biol. 19(5):3614–3623.
● Rochdi, M.D. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(18):18981–18989.
DNA-BD載體（pGBKT7 vector）的核定位序列是天然GAL4蛋白固有的一部分，位于結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基末端。精確的位點(diǎn)及有關(guān)描述可以參考Fields & Song (1989)。天然GAL4 AD中不帶有核定位序列，所以在GAL4 AD 載體的激活區(qū)域添加了SV40 T-抗原核定位序列。
我們不確定可以用于酵母雙雜篩選最小的bait蛋白為多大。以經(jīng)驗(yàn)來看，bait也不宜過大，過大的外源性融合蛋白在酵母中不穩(wěn)定，我們推薦bait不超過100kD，或bait載體的DNA插入片段不超過3kb。大多數(shù)情況下，bait的設(shè)計(jì)依賴于經(jīng)驗(yàn)，很難確定bait的效果會如何。酵母雜交中插入片段的N端與147個氨基酸的GAL4 BD融合表達(dá)，這可能會影響蛋白折疊，以及插入的結(jié)構(gòu)域能否進(jìn)行蛋白互作。比較大的bait可能會引起非特異性互作而提高背景，推薦使用較小的、特異的bait進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。小至8個氨基酸，大至750個氨基酸的蛋白都已經(jīng)被成功用于酵母雙雜交研究。
● Heery, D.M. et al. (1997) Nature 387(6634):733–736.
● Schaefer B.C., Ed. (1997) Gene Cloning and Analysis: CurrentInnovations,
(Horizon Scientific Press), pp 11–28.
頁面更新：2018-10-23 09:57:35
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