大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都會(huì)在PCR產(chǎn)物的3′末端添加一個(gè)“A”，T載體是3′帶有一個(gè)“T”的載體，在連接酶作用下，完成連接，其連接液可以直接用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化，大大方便了實(shí)驗(yàn)操作。TA克隆的原理請見下圖：
藍(lán)白斑篩選原理是：載體上攜帶一段細(xì)菌的lacZ基因，它編碼β-半乳糖苷酶的一段146個(gè)氨基酸的α-肽，載體轉(zhuǎn)化的受體菌為lacZ△M15基因型。這樣，載體同宿主通過互補(bǔ)，具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在載體的lacZ基因中插入外源DNA，造成lacZ基因缺失，不能合成α-肽，失去同宿主的互補(bǔ)，不能形成有功能的β-半乳糖苷酶，失去分解X-gal的能力。在X-gal平板上，含陽性重組體的細(xì)菌為白色菌落（質(zhì)粒載體）或無色噬菌斑（M13噬菌體載體）；非重組體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌為藍(lán)色菌落或藍(lán)色噬菌斑。
常用的PCR產(chǎn)物克隆用T載體及各自的特點(diǎn)請見下表：
| Code No. | 產(chǎn)品 | 特點(diǎn) | 應(yīng)用 |
| 3275 | pBackZero-T Vector Cloning Kit | 由pUC19改建，陽性克隆率極高而背景極低。它消除了pUC19載體上的lacZ基因及多克隆位點(diǎn)，并對β-lactamase (bla) 基因進(jìn)行了獨(dú)特的改造，可以定向克隆。 | 使用時(shí)需在待插入的DNA片段的上、下游Primer的5′端加上TTTAA 5個(gè)堿基。如果需要進(jìn)行定向克隆，只需在一條引物的5′端加上TTTAA 5個(gè)堿基。 PCR產(chǎn)物3′端有“A”，TA克隆。 |
| 6011 | pMD™18-T Vector Cloning Kit | 由pUC18構(gòu)建，含有多克隆位點(diǎn)，可以進(jìn)行藍(lán)白篩選，無方向性克隆。 | PCR產(chǎn)物3′端有“A”，TA克隆。 |
| 6013 | pMD™19-T Vector Cloning Kit | 由pUC19構(gòu)建，含有多克隆位點(diǎn)，可以進(jìn)行藍(lán)白篩選，無方向性克隆。 | PCR產(chǎn)物3′端有“A”，TA克隆。 |
| 3271 | T-Vector pMD™19 (Simple) | 由pUC19構(gòu)建，不含有多克隆位點(diǎn)，可以進(jìn)行藍(lán)白篩選，無方向性克隆。 | PCR產(chǎn)物3′端有“A”，TA克隆。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，可以在引物的5＇端導(dǎo)入酶切位點(diǎn)。 |
| 6012 | pSIMPLE-19 EcoR V /BAP Vector | 由pUC19構(gòu)建，不含有多克隆位點(diǎn)，是種平末端去磷酸化載體，可以進(jìn)行藍(lán)白篩選，無方向性克隆。 | 與5′端磷酸化的平末端PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接。 |
| 3270 | T-Vector pMD™20 | 由pUC19構(gòu)建，含有多克隆位點(diǎn)；并對lacZ基因進(jìn)行改造，降低假陽性，可以進(jìn)行藍(lán)白篩選，無方向性克隆。 | PCR產(chǎn)物3′端有“A”，TA克??；含有SP6 Promoter，可以對插入的DNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。 |
pMD19-T Vector與pMD18-T Vector相比，β-半乳糖苷酶的表達(dá)活性更高，菌落顯示藍(lán)色的時(shí)間縮短，菌落顯示的藍(lán)色更深。pMD18-T Vector連接轉(zhuǎn)化后，一般要經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)，然后再將其于冰箱內(nèi)放置一段時(shí)間后，其藍(lán)白菌落才能顯色。而pMD19-T Vector涂板培養(yǎng)后一般只需10個(gè)小時(shí)（37℃）便可以顯色。因此，pMD19-T Vector比pMD18-T Vector更適合于藍(lán)白菌落的篩選。
轉(zhuǎn)化時(shí)請使用高效的感受態(tài)細(xì)胞（轉(zhuǎn)化效率≥1×108 cfu/μg pUC19），這樣才可能得到比較理想的陽性克隆。如果需要進(jìn)行藍(lán)白篩選時(shí)，宿主細(xì)胞必須具有正確的基因型（F′編碼的［lacZ△M15］）產(chǎn)生ω Fragment，才可能和載體DNA產(chǎn)生的lacZ α多肽相結(jié)合，表現(xiàn)出β-半乳糖苷酶活性（α-互補(bǔ)性），才可以進(jìn)行藍(lán)白篩選。通常使用的JM109，DH5α等細(xì)胞均可進(jìn)行藍(lán)白篩選。
使用Takara克隆用T載體，對Insert DNA有以下的要求：
1．Insert DNA應(yīng)該進(jìn)行切膠回收的純化處理后才進(jìn)行載體連接，盡量避免引物等其它雜質(zhì)的存在。切膠回收時(shí)可使用Takara凝膠回收試劑盒（Code No. 9762）。
2．Insert DNA的使用量及計(jì)算方法。
進(jìn)行克隆時(shí)，Vector DNA和Insert DNA的摩爾數(shù)比一般為1：3～10，可以根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)情況選擇合適的Vector DNA和Insert DNA的摩爾數(shù)比。
Insert DNA使用量的計(jì)算方法如下：
Insert DNA的使用量（ng）=nmol數(shù)×660×Insert DNA的bp數(shù)
Takara的T載體1 μl（50 ng）的摩爾數(shù)約為0.03 pmol。
取0.1 ng的pUC19 Plasmid DNA加入至100 μl的感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，再加入900 μl的SOC培養(yǎng)基（0.1 ng DNA/ml），將上述培養(yǎng)液稀釋10倍后（0.01 ng DNA/ml）取100 μl涂布平板（0.001 ng DNA/100 μl），記錄菌落數(shù)。以得到200個(gè)克隆體為例計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，此時(shí)的轉(zhuǎn)化效率=200 cfu/0.001 ng=2×105 cfu/ng=2×108 cfu/μg pUC19 DNA。
插入的DNA片段較短（小于500 bp），且插入片段沒有影響lacZ基因的讀框，此時(shí)平板培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落有可能呈現(xiàn)藍(lán)色（或淡藍(lán)色）。
應(yīng)該從以下幾點(diǎn)進(jìn)行改善
1．確認(rèn)Insert DNA片段的3′末端是否帶有“A”尾。大部分的高保真DNA聚合酶（如：Pyrobest、PrimeSTAR HS、KOD、Pfx、Pfu等）擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物是平滑末端，不能直接進(jìn)行TA克隆。
2．純化PCR產(chǎn)物。最好使用切膠回收的PCR片段，以除去PCR產(chǎn)物中的非特異性片段和引物等雜質(zhì)。進(jìn)行切膠回收時(shí)可以使用Takara凝膠回收試劑盒（Code No. 9762）。
3．請使用轉(zhuǎn)化效率大于108 cfu/μg pUC19 DNA的感受態(tài)細(xì)胞。
4．DNA片段的立體結(jié)構(gòu)、DNA片段的長短都會(huì)影響克隆效率。一般情況下，大片段DNA的克隆效率（連接效率與轉(zhuǎn)化效率）偏低，此時(shí)可以延長連接反應(yīng)時(shí)間，或采用電轉(zhuǎn)化方法。
5．進(jìn)行切膠回收純化DNA片段時(shí)，不要使DNA片段在紫外線下暴露時(shí)間過長。
6．Solution I應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。
7．建議使用新配制的平板培養(yǎng)基。
通常使用載體的通用引物進(jìn)行測序。
1．pMD18-T Vector來源于pUC18載體，M13-47和RV-M等pUC18載體測序的通用引物都可以使用。
2．pMD19-T Vector、T-Vector pMD™19 (Simple)和pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector來源于pUC19載體，M13-47和RV-M等pUC19載體測序的通用引物都可以使用。
3．T-Vector pMD™20來源于pUC19載體，M13-47和RV-M等pUC19載體測序的通用引物都可以使用。
使用Takara克隆用T載體，應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)：
1．Solution I請于冰中融解。
2．克隆時(shí)使用的Insert DNA片段（PCR產(chǎn)物）建議進(jìn)行切膠回收純化，否則PCR產(chǎn)物中的短片段DNA（甚至是電泳也無法確認(rèn)的非特異性小片段）、殘存引物等雜質(zhì)都會(huì)影響TA克隆效率。
3．按照本實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行連接后，直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)的連接液不要超過20 μl。當(dāng)要轉(zhuǎn)化的DNA量較大或準(zhǔn)備進(jìn)行電轉(zhuǎn)化時(shí)，需對連接液進(jìn)行乙醇沉淀，純化DNA后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。進(jìn)行乙醇沉淀時(shí)使用Dr.GenTLE® Precipitation Carrier（Code No. 9094）可以提高DNA的回收率。
4．連接反應(yīng)請?jiān)?5℃以下進(jìn)行，溫度升高（>26℃）較難形成環(huán)狀DNA。連接效率偏低時(shí)，可適當(dāng)延長連接反應(yīng)時(shí)間至數(shù)小時(shí)。
5．Takara克隆用T載體來源于pUC18或pUC19載體。因此，適合pUC18和pUC19載體的感受態(tài)細(xì)胞都可以使用，如：JM109等。
陽性克隆的鑒定方法有多種，主要的方法有以下幾種：
1．藍(lán)白斑篩選。
藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法，一般情況下，β-半乳糖苷酶的表達(dá)將受到破壞，重組克隆體在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)將顯示白色菌落。但有時(shí)比較短的DNA片段插入載體時(shí)，基因的讀碼框有可能正好與lacZ的讀碼框相吻合，克隆體也會(huì)顯示藍(lán)色菌落。有報(bào)道稱，2 kb的DNA片段插入到載體中后，重組克隆體仍顯示了藍(lán)色。所以，當(dāng)我們沒有得到白色菌落時(shí)，可以試著檢測藍(lán)色菌落。
2．菌落PCR方法。
以變性后的菌液為模板，使用載體通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。
使用滅菌后的牙簽挑取白色菌落，在預(yù)備好的dH2O（10 μl）中蘸洗，99℃，10 min變性，冰上急冷，加入配制好的PCR混合液（引物，dNTP，Buffer，TaKaRa Taq等）。
| 94℃ | 1 min |  |
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| 94℃ | 30 sec | ||
| 55℃ | 30 sec | 30 Cycles | |
| 72℃ | 1 kb/min |
| 94℃ | 1 min | |
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| 94℃ | 30 sec | ||
| 55℃ | 30 sec | 30 Cycles | |
| 72℃ | 1 kb/min |
作為模板的菌落中，若混雜有微量的PCR產(chǎn)物，使用PCR擴(kuò)增用引物就能檢測到目的條帶，而并非菌落自身擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。為了避免出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，建議使用載體上的通用引物作為鑒定陽性克隆的擴(kuò)增引物。
TA克隆沒有方向性，但是可以通過以下方法進(jìn)行方向的鑒定。
1．PCR方法。
使用載體上的一條通用引物和PCR擴(kuò)增的一條引物，分別作為PCR擴(kuò)增的上下游引物，對陽性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過是否有擴(kuò)增產(chǎn)物來判斷片段插入的方向。
2．酶切方法。
利用載體多克隆位點(diǎn)上的一個(gè)限制酶和PCR引物導(dǎo)入的酶切位點(diǎn)的一個(gè)限制酶，對陽性克隆質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切鑒定。
可以從以下幾點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)：
1. 為了提高加“A”反應(yīng)效率，用于加“A”反應(yīng)的末端平滑DNA片段應(yīng)進(jìn)行切膠回收的純化處理，盡量避免引物等其它雜質(zhì)的存在。切膠回收時(shí)可使用Takara凝膠回收試劑盒（Code No. 9762）。
2. 請使用轉(zhuǎn)化效率大于108 cfu/μg pUC19 DNA的感受態(tài)細(xì)胞。
3. DNA片段的立體結(jié)構(gòu)、DNA片段的長短都會(huì)影響克隆效率。一般情況下，大片段DNA的克隆效率（連接效率與轉(zhuǎn)化效率）偏低，此時(shí)可以延長連接反應(yīng)時(shí)間，或采用電轉(zhuǎn)化方法。
4. 進(jìn)行切膠回收純化DNA片段時(shí)，不要使DNA片段在紫外線下暴露時(shí)間過長。
5. Solution I應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。
6. 建議使用新配制的平板培養(yǎng)基。
插入的DNA片段較短（小于500 bp），且插入片段沒有影響lacZ基因的讀框，此時(shí)平板培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落有可能呈現(xiàn)藍(lán)色（或淡藍(lán)色）。
頁面更新：2020-04-26 13:10:16
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