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機(jī)構(gòu)用戶解決方案

產(chǎn)品選擇指南

技術(shù)服務(wù)信息

Q-1：若三次PCR擴(kuò)增結(jié)果均顯示清晰條帶，是否要將三次的清晰條帶都進(jìn)行DNA的回收測(cè)序?
A-1：

不需要。后一個(gè)特異性產(chǎn)物要比前一個(gè)短60～100 bp，當(dāng)3rd PCR產(chǎn)物比2nd PCR產(chǎn)物稍短時(shí)，可以只回收3rd PCR產(chǎn)物。1st PCR產(chǎn)物基本上是AP引物的自擴(kuò)產(chǎn)物或SP1引物的非特異性擴(kuò)增結(jié)果，不需要回收測(cè)序。

Q-2：利用普通的PCR擴(kuò)增儀能否完成本實(shí)驗(yàn)?
A-2：

Genome Walking Kit在進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)條件比較復(fù)雜，我們使用的是TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（Code No. TP600）PCR擴(kuò)增儀。使用其他PCR擴(kuò)增儀（一個(gè)程序內(nèi)不能設(shè)定9個(gè)溫度梯度的PCR儀）時(shí)，可采用手動(dòng)重復(fù)操作來(lái)完成實(shí)驗(yàn)。
具體可參考以下條件設(shè)定。
對(duì)于以下的循環(huán)條件：

94℃ 30 sec； 65℃ 1 min； 72℃ 2 min  
94℃ 30 sec； 65℃ 1 min； 72℃ 2 min 15 Cycles
94℃ 30 sec； 44℃ 1 min； 72℃ 2 min  
可以設(shè)定為：
94℃        30 sec
65℃        1 min
72℃        2 min
94℃        30 sec
65℃        1 min
72℃        2 min
94℃        30 sec
44℃        1 min
72℃        2 min
將以上循環(huán)條件，用手動(dòng)重復(fù)操作15次即可完成反應(yīng)。
Q-3：Genome Walking Kit的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件是否具有物種通用性?
A-3：

Genome Walking Kit的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件經(jīng)過(guò)對(duì)典型物種的研討，可以適用于多種物種。一般情況下，四種AP引物中至少會(huì)有一種可以擴(kuò)增出目的DNA片段。

Q-4：如果四種AP引物都沒(méi)有擴(kuò)增得到清晰條帶，原因是什么，應(yīng)怎樣解決?
A-4：

原因及相應(yīng)的解決方法如下：
1．如果后兩次PCR擴(kuò)增都沒(méi)有得到清晰條帶，可以嘗試將上一步的PCR反應(yīng)液進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋，然后再進(jìn)行PCR反應(yīng)。
2．可能是起始基因組DNA模板中存在有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，此時(shí)可以嘗試降低基因組DNA的用量或重新純化基因組DNA。
3．特異性引物的設(shè)計(jì)對(duì)側(cè)翼序列的獲取起有至關(guān)重要的作用。當(dāng)使用四條AP引物均無(wú)理想結(jié)果時(shí)，應(yīng)考慮重新設(shè)計(jì)特異性引物。特異性引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守說(shuō)明書(shū)中關(guān)于特異性引物設(shè)計(jì)的原則。
4．可以嘗試適當(dāng)增加3rd PCR反應(yīng)的循環(huán)圈數(shù)。

Q-5：是否可以只使用一種AP引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?
A-5：

可以首先使用一種AP引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但為了提高實(shí)驗(yàn)成功率，我們建議使用四種AP引物同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，理論上至少會(huì)有一種以上的AP引物能夠得到理想結(jié)果。

Q-6：獲取的側(cè)翼序列測(cè)序有套峰，是什么原因?
A-6：

原因可能是非特異性擴(kuò)增，或PCR產(chǎn)物不純，也有可能是DNA本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜。可以重新設(shè)計(jì)測(cè)序引物，或考慮克隆測(cè)序。

Q-7：第一次和第二次反應(yīng)能否使用25 μl體系?
A-7：

我們?cè)鴩L試使用過(guò)25 μl反應(yīng)體系，但結(jié)果并不如50 μl體系理想，所以我們推薦使用50 μl反應(yīng)體系。

Q-8：是否可以使用一般的Taq酶代替TaKaRa LA Taq?
A-8：

我們?cè)褂眠^(guò)其它Taq酶，但結(jié)果不如TaKaRa LA Taq理想。我們推薦使用TaKaRa LA Taq 。

頁(yè)面更新：2020-04-26 13:23:21