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Q-1：各種連接酶特性的比較?

A-1：

各種連接酶特性比較請(qǐng)見下表：

		T4 DNA Ligase	E.coli DNA Ligase	T4 RNA Ligase
分子量最適pH 輔酶還原劑		約62,000 7.2～7.8 ATP +	約77,000 7.5～8.0 NAD -	約47,000 7.2～8.4 ATP +
連接反應(yīng)	平滑末端 DNA 5’P末端和RNA 3’OH末端 RNA 5’P末端和DNA 3’OH末端 RNA和RNA	可能可能可能少數(shù)可能	不能（+PEG可能）不能不能不能	不能不能不能可能

Q-2：T4 DNA Ligase的反應(yīng)體系是什么?

A-2：

使用例
DNA片段和載體DNA的連接
1. 在微量離心管中制備下列連接反應(yīng)液。

10×T4 DNA Ligase Buffer	2.5	μl
DNA片段^*	約0.3	pmol
載體DNA^**	約0.03	pmol
T4 DNA Ligase	1	μl
滅菌水	up to 25	μl

* DNA片段的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體DNA摩爾數(shù)的3～10倍。
** 平滑末端的載體與DNA片段進(jìn)行連接時(shí)，應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，以防止其自身環(huán)化。
2. 16℃過夜反應(yīng)。
3. 加入2.5 μl（1/10量）的3 M CH3COONa（pH5.2）。
4. 加入62.5 μl（2.5倍量）的冷無(wú)水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
5. 離心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
6. 25～50 μl TE溶解，10～20 μl轉(zhuǎn)化至100 μl的感受態(tài)細(xì)胞中。

Q-3：使用T4 DNA Ligase時(shí)，與分子內(nèi)連接反應(yīng)相比，容易發(fā)生分子間連接反應(yīng)的DNA濃度為多少?

A-3：

與DNA分子大小有關(guān)，DNA濃度越稀越容易發(fā)生分子內(nèi)連接反應(yīng)。
從理論上講，計(jì)算式：51.1/（DNA濃度：g/l）÷（分子量：dalton）^0.5的值如果小于1就容易發(fā)生分子間的連接反應(yīng)，大于2則易發(fā)生分子內(nèi)的連接反應(yīng)。
例如：
對(duì)于λDNA（48,502 bp），濃度大于1 μg/100 μl時(shí)，容易發(fā)生分子間連接；濃度小于1 μg/200 μl時(shí)，容易發(fā)生分子內(nèi)連接。
對(duì)于質(zhì)粒載體（約3,000 bp），濃度大于1 μg/25 μl時(shí)，容易發(fā)生分子間連接；濃度小于1 μg/50 μl時(shí)，容易發(fā)生分子內(nèi)連接。

Q-4：使用T4 DNA Ligase時(shí)，平滑末端及突出末端的連接效率的差別?

A-4：

連接效率取決于末端堿基序列。
連接反應(yīng)因末端堿基順序的不同而反應(yīng)速度各異，一般有下列傾向：
突出末端：Hind III＞Pst I＞EcoR I＞BamH I＞Sal I
平滑末端：Hae III＞Alu I＞Hinc II＞Sma I
EcoRV＞Sca I＞Pvu II＞Nru I
其中連接Hind III末端的速度約為連接Sal I末端速度的10～40倍；
而連接Hae III末端的速度約為連接Sma I末端速度的5～10倍。
與平滑末端相比，突出末端的連接效率大約高出100倍以上。

Q-5：使用T4 DNA Ligase時(shí)，在10%聚乙二醇存在的條件下，可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化嗎?

A-5：

在100 μl感受態(tài)細(xì)胞中加入小于10 μl的連接液（含10% PEG）進(jìn)行轉(zhuǎn)化沒有問題。有可能的話，建議通過乙醇沉淀進(jìn)行Buffer交換。

Q-6：使用T4 DNA Ligase時(shí)，要想讓DNA環(huán)化，鹽濃度（NaCl、KCl等）多少為好?

A-6：

想使DNA環(huán)化（Self ligation）時(shí)，請(qǐng)使用不含一價(jià)鹽的緩沖液。PEG及高鹽濃度可以促進(jìn)分子間的連接反應(yīng)；而對(duì)于分子內(nèi)的連接反應(yīng)，使用不含鹽的Buffer可以得到更好的效果。

Q-7：使用T4 DNA Ligase時(shí)，連接液是否需要乙醇沉淀純化之后再轉(zhuǎn)化?

A-7：

熱擊轉(zhuǎn)化時(shí)，無(wú)需乙醇沉淀，可用連接液直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
電轉(zhuǎn)化時(shí)，需要對(duì)連接液進(jìn)行乙醇沉淀純化，去除鹽離子再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

乙醇沉淀的步驟：
1. 加入1/10體積的3 M CH3COONa（pH5.2），混勻。
2. 加入2.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻，-20℃放置30～60分鐘。
3. 12,000 rpm，4℃離心10 min，回收沉淀
4. 用1 ml 70％的預(yù)冷乙醇清洗沉淀，12,000 rpm，4℃離心10 min，除去上清，真空或室溫干燥沉淀，注意不要干燥過度。
5. 使用25～50 μl TE Buffer溶解，取10～20 μl轉(zhuǎn)化至100 μl的感受態(tài)細(xì)胞中。

Q-8：T4 DNA Ligase與DNA Ligation Kit Ver.2.1（Code No. 6022）的區(qū)別?

A-8：

T4 DNA Ligase經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)16小時(shí)的連接反應(yīng)才能連接成功，而且反應(yīng)常常受到DNA末端結(jié)構(gòu)的影響。DNA Ligation Kit Ver.2.1中的Solution I含有T4 DNA Ligase，利用了T4 DNA Ligase及其相應(yīng)的最佳緩沖體系，由于它的高效連接性能，可以將反應(yīng)時(shí)間縮短至半個(gè)小時(shí)，并且不受DNA結(jié)構(gòu)的影響。在使用DNA Ligation Kit進(jìn)行環(huán)狀DNA連接時(shí)，只需向DNA溶液中加入Solution I，即可在短時(shí)間內(nèi)完成DNA連接。

Q-9：T4 RNA Ligase的應(yīng)用?

A-9：

該連接酶主要是應(yīng)用于單鏈分子內(nèi)連接的環(huán)化反應(yīng)以及分子間的連接反應(yīng)。最小底物為NpNpNOH（3’-OH Oligomer、受體）、pNp（5’、3’-DP monomer、供體）。連接效率受供體和受體各自的堿基影響很大。與RNA相比DNA連接的效率較低。

Q-10：使用T4 RNA Ligase要注意哪些問題？

A-10：

使用T4 RNA Ligase的注意事項(xiàng)有以下幾點(diǎn)：
1. 分子間連接反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度為5～15℃，若超過該溫度活性會(huì)被抑制。
2. 在PEG共存的條件下能夠促進(jìn)反應(yīng)，而反應(yīng)特異性不變。為了提高連接反應(yīng)效率，建議使用酶濃度高而ATP濃度盡量低的反應(yīng)條件。
3. 在10×反應(yīng)緩沖液中如果直接加入0.1%的BSA會(huì)產(chǎn)生大量白色沉淀，因此在配制反應(yīng)液時(shí)，請(qǐng)按下面順序添加試劑：
dH2O→10×Buffer→0.1% BSA→底物RNA or DNA。

Q-11：使用T4 RNA Ligase如何終止反應(yīng)?

A-11：

加入2 μl的0.5 M EDTA螯合Mg²⁺終止反應(yīng)。

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