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Q-1：大腸桿菌來源的酶（BAP）、小牛腸來源的酶（CIAP）特性比較?: A-1：
BAP、CIAP特性比較請見下表：

Q-2：BAP、CIAP和SAP的區(qū)別?: A-2：
為有效降低線性化質(zhì)粒的自連背景，需在連接反應(yīng)前將線性化載體去磷酸化，因此要用到堿性磷酸酶。BAP、CIAP和SAP三種堿性磷酸酶都可以去除載體或片段的5’-末端磷酸基團(tuán)，但失活方法不同。
CIAP：在保存條件下極其穩(wěn)定，但在螯合劑存在的條件下，經(jīng)65℃、30分鐘加熱處理，99%的活性不可逆失活（根據(jù)反應(yīng)條件不同有時也有例外）。建議失活處理時使用苯酚，可使酶完全失活。
BAP：是一種穩(wěn)定性很高、每一個酶分子中含有2個Zn²⁺的金屬蛋白質(zhì)。在螯合劑存在的條件下，100℃加熱可暫時性失活，但由于恢復(fù)至室溫時酶活性可以恢復(fù)，因此必須進(jìn)行苯酚處理，才能使其完全失活。
SAP：只要乙醇沉淀即可失活。

苯酚/氯仿抽提方法：
1. 加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振蕩2～3 min充分混勻。
2. 室溫12,000 rpm離心，取上層（水層）移至另一微量離心管中。
3. 加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1），振蕩2～3 min充分混勻。
4. 室溫12,000 rpm離心，取上層（水層）移至另一微量離心管中。然后進(jìn)行乙醇沉淀純化。

乙醇沉淀的步驟：
1. 加入1/10體積的3 M CH3COONa（pH5.2），混勻。
2. 加入2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30～60分鐘。
3. 12,000 rpm，4℃離心10 min，回收沉淀。
4. 用1 ml 70%的預(yù)冷乙醇清洗沉淀，12,000 rpm，4℃離心10 min，除去上清，真空或室溫干燥沉淀，注意不要干燥過度。
5. 取適量TE Buffer或滅菌水溶解。

Q-3：SAP降解PCR反應(yīng)后殘存dNTP的反應(yīng)體系?

A-3：

SAP降解PCR反應(yīng)后殘存dNTP的反應(yīng)體系如下表：

PCR Product	6	μl
SAP（1 U/μl）	0.2	μl
Exonuclease I（5 U/μl）	0.2	μl
dH2O	up to 10	μl

37℃反應(yīng)2小時

80℃反應(yīng)15分鐘

可做測序反應(yīng)

Q-4：提高Alkaline Phosphatases去磷酸化處理的效率的方法?: A-4：
通過下述的一種或兩種操作能夠提高去磷酸化處理的效率。
1. 提高反應(yīng)溫度進(jìn)行反應(yīng)（BAP：65℃，CIAP：約50℃）。
2. 把反應(yīng)液中的Tris的濃度提高到1 M。

Q-5：限制酶處理后，不經(jīng)過Buffer更換可以直接使用CIAP嗎?: A-5：
與最適條件相比效率會降低幾分之一到十分之一左右，但由于酶一般為過量使用，如果DNA是5’突出末端則沒有問題。但若5’凹陷末端，應(yīng)盡量進(jìn)行Buffer更換，在較高的溫度下（50℃左右）反應(yīng)。

Q-6：CIAP對金屬離子的要求如何?: A-6：
不需要Zn²⁺。Mg²⁺濃度在0.5 mM時活性較0.1 mM時約提高3倍。

Q-7：5’末端結(jié)構(gòu)不同，反應(yīng)條件有何不同?: A-7：
平滑末端及5’-凹陷末端的去磷酸反應(yīng)，建議使用BAP（Code No. 2120）在高溫（55℃～60℃）條件下反應(yīng)。

Q-8：載體去磷酸化反應(yīng)后，如何檢測?: A-8：
推薦使用苯酚/氯仿/異戊醇抽提或凝膠回收純化去磷酸的線性化DNA。
檢測去磷酸化反應(yīng)效果的方法：
1. 將去磷酸化處理的酶切線性載體，進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、涂板。
2. 將酶切線性載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、涂板。
3. 將酶切線性載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、涂板。
載體用量：大約0.03 pmol以上即可。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：如果去磷酸化效率較高，1.的菌落數(shù)與2.的菌落數(shù)接近；1.的菌落數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于3.的菌落數(shù)。

Q-9：T4 Polynucleotide Kinase催化5’末端標(biāo)記反應(yīng)的效率如何?: A-9：
T4 Polynucleotide Kinase（T4 PNK）催化的核酸5’末端標(biāo)記反應(yīng)的效率受5’末端形狀的影響較強(qiáng)。一般效率按：單鏈末端≥雙鏈5’突出末端＞雙鏈平滑末端＞雙鏈3’突出末端的順序降低。特別是由于雙鏈的缺口（Gap）及切口（Nick）部分的磷酸化非常困難，所以，為了提高標(biāo)記效率需要使用高濃度、過量的ATP。另外，即使同為平滑末端，富含AT的末端標(biāo)記效率較高。
進(jìn)行非標(biāo)記的磷酸化反應(yīng)時，請?jiān)诜磻?yīng)液中加入終濃度1 mM的ATP。本制品中不另添附ATP。

Q-10：T4 Polynucleotide Kinase的失活方法?: A-10：
本酶在70℃加熱5分鐘即可失活。

Q-11：使用T4 PNK標(biāo)記DNA時，能用〔γ-³⁵S〕代替〔γ-³⁵P〕ATP嗎?: A-11：
可以。但酶濃度要比使用〔γ-³⁵P〕ATP時高2～3倍。

頁面更新：2020-04-27 09:50:16

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