各種DNA Polymerase的特性比較列表：
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Klenow Fragment的補(bǔ)平反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下：
| DNA | 500 | ng | |
| 10×buffer | 2.5 | μl | |
| dNTP | final 0.1 | mM | |
| Klenow | 0.5 | U | |
| dH2O | Up to 25 | μl |
37℃ 15 min
T4 DNA Polymerase具有比Klenow Fragment高出100～1,000倍的3’-Exonuclease活性。但Klenow不象T4 DNA Polymerase那樣易受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響。因此，Klenow一般用于Dideoxy法測序、DNA的3’凹陷末端補(bǔ)平以及3’-末端標(biāo)記；而T4 DNA Polymerase則用于DNA置換合成以及3’-末端平滑化。
另外，對于dNTP〔aS〕的活性也不同。Klenow雖然能使dNTP〔aS〕摻入，但不能利用Exonuclease活性切除。所以，想使DNA只從單方向缺失時，使用Klenow和dNTP〔aS〕修復(fù)一端后，其末端會對Klenow的Exonuclease活性以及BAL 31、Exo III等活性產(chǎn)生拮抗作用。而T4 DNA Polymerase即使摻入了dNTP〔aS〕也會切除掉。
Klenow補(bǔ)平3’末端后，一般多加一個堿基。突出末端通過3’-Exonuclease活性可以去除，但由于效率低，只能使50％左右的DNA末端平滑化。為了使DNA末端完全平滑化，建議使用T4 DNA Polymerase或者DNA Blunting Kit（Code No. 6025）。
與37℃時相比，約為1/2～1/3。由于在低溫條件下3’-Exonuclease活性被抑制，因此，在低溫下進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)時應(yīng)盡量延長反應(yīng)時間（10℃，1hr or 0℃，3hr）。此時1 μg DNA使用酶量約3 U。
由于Klenow具有3′-Exonuclease活性（其單鏈特異性是相對的，對雙鏈也作用），1 μg DNA使用1 U以上的酶時修復(fù)效果會下降。因此，相當(dāng)于1 μg DNA請使用0.1 U左右的酶。另外，可以使反應(yīng)在低溫（10℃，1hr or 0℃，3hr）下進(jìn)行。
Klenow對ddNTP的識別要比dNTP低103左右，必須極過量加入ddNTP才能完全修復(fù)。因此建議使用反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄酶對于ddNTP的識別不嚴(yán)格，也沒有3′-Exonuclease活性，修復(fù)后不發(fā)生切入現(xiàn)象，可能會比Klenow更容易使用。
必須。但未必4種都需要。平滑時，只要向反應(yīng)體系中加入0.1 mM左右平滑后的3’端最邊上的堿基即可。T4 DNA Polymerase，1 U，37℃，5 min即可完成反應(yīng)。
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| 不能，雖然5’突出的去磷酸化DNA可作底物，但不能作用3′-凹陷末端具有磷酸基的DNA。用Mung Bean Nuclease（Code No. 2420A）作用可形成平滑末端。 |
反應(yīng)體系中須嚴(yán)格注意不要混入RNase。
實驗器材（如：槍頭、Microtube等）注意嚴(yán)格使用RNase Free用品。
實驗操作時請注意戴一次性手套，防止RNase污染。
SP6 RNA Polymerase的使用注意事項：
1. 最適pH為7.5，需要Mg2+和還原劑的存在，添加BSA及亞精胺可提高酶的活性。
2. 最適反應(yīng)溫度為40℃（此時酶活性為37℃時的130%），當(dāng)所用酶量不超過300 U/ml，模板量不超過0.1 mg/ml時與RNA的合成量呈正比例。如果反應(yīng)時間超過1小時，反應(yīng)溫度以37℃為好。
3. 為了特定領(lǐng)域的有效轉(zhuǎn)錄，建議在其領(lǐng)域下游把模板DNA預(yù)先切成平端或5’突出末端。使用時，在反應(yīng)緩沖液中必須添加DTT及BSA，否則有時不表現(xiàn)活性。
T7 RNA Polymerase的使用注意事項：
1. 最適pH為7.7～8.3。需要Mg2+和還原劑的存在，添加BSA及亞精胺可提高酶的活性。
2. 為了特定領(lǐng)域的有效轉(zhuǎn)錄，建議在其領(lǐng)域下游把模板DNA預(yù)先切成平端或5’突出末端。
3. 為了使T7 RNA Polymerase能夠進(jìn)行有效反應(yīng)，在設(shè)計合成用于體外轉(zhuǎn)錄的模板用Oligo DNA時，T7 Promoter序列之前（5’端方向）應(yīng)多加6個堿基。根據(jù)我們的經(jīng)驗，以加GATCAC為佳。
相關(guān)產(chǎn)品：in vitro Transcription T7 Kit（for siRNA Synthesis）（Code No. 6140）
反應(yīng)結(jié)束后，最好進(jìn)行Recombinant DNase I (RNase-free)（Code No. 2270A）進(jìn)行處理，以分解殘存在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品中的DNA模板。
使用例
在RNA上加上Poly(A)尾
1.在微量離心管中配制下列反應(yīng)液。
| 10×Poly(A) Polymerase Buffer | 5 | μl | |
| MnCl2 | 5 | μl | |
| DTT | 5 | μl | |
| 0.1% BSA | 10 | μl | |
| ATP | 0.5 | μl | |
| RNA | 10 | μM | |
| Poly(A) Polymerase（2 U/μl） | 5 | U | |
| dH2O | Up to 50 | μl |
2. 37℃反應(yīng)30分鐘。
3. 加入50 μl（等量）的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），充分混勻。
4. 離心，取上層（水層）移至另一微量離心管中。
5. 加入50 μl（等量）的氯仿/異戊醇（24：1），充分混勻。
6. 離心，取上層（水層）移至另一微量離心管中。
7. 加入5 μl（1/10量）的3 M NaOAC（pH5.2）。
8. 加入125 μl（2.5倍量）的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
9. 離心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
10. 用于以后實驗。
注）如需得到高純度的Poly(A)RNA時，可以在操作2.后用Oligo(dT)-Cellulose層析進(jìn)行純化。
酶催化dNTP聚合于單鏈或雙鏈DNA的3’-OH末端的反應(yīng)，該反應(yīng)不需要模板，但引物必須是至少有3個以上堿基的寡核苷酸。
TdT通過Okayama-Berg法被廣泛運用于給載體、cDNA加上互補(bǔ)同聚尾的反應(yīng)。反應(yīng)受以下條件的影響：
1. 附加堿基的種類（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）
2. 反應(yīng)緩沖液中二價陽離子的種類（Mg2+，Co2+，Mn2+）
3. DNA末端結(jié)構(gòu)（3’-OH突出末端，平滑末端，3’-OH凹陷末端）。
反應(yīng)時要根據(jù)情況選擇最佳反應(yīng)條件。一般，附加dATP和dTTP時，選擇Co2+的Buffer；而附加的dCTP和dGTP時，選擇含有Mn2+的Buffer為最適。附加15～40 base核苷酸的最佳反應(yīng)條件為：
突出3’-OH末端：dNTP與DNA的摩爾比為20：1。
凹陷3’-OH末端：dNTP與DNA的摩爾比為100：1。
4. 有公司使用的反應(yīng)緩沖液中含有二甲砷酸鈉（劇毒）成份，使用起來很不方便且易發(fā)生危險。本公司推出的不含二甲砷酸鈉的反應(yīng)緩沖液，絲毫不影響酶的反應(yīng)性能。
頁面更新：2020-04-27 09:58:58
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