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當(dāng)前位置:首頁 > 技術(shù)資料 > 相關(guān)問答 > Takara > cDNA合成 & 克隆 > 修飾酶-核酸酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶
Q-1:各種Nuclease的特性比較?
A-1:

各種Nuclease的特性比較列表如下:
Endonuclease(核酸內(nèi)切酶)種類:
S1 Nuclease,Mung Bean Nuclease,BAL 31 Nuclease(單鏈),Micrococcal Nuclease,Deoxyribonuclease I,Ribonuclease H
Exonuclease(核酸外切酶)種類:
Exonuclease I,Exonuclease III,BAL 31 Nuclease(雙鏈)

 

S1 Nuclease

Mung Bean Nuclease

Exonuclease I

Exonuclease III

反應(yīng)特異性

Endonuclease
ssDNA,ssRNA

Endonuclease
ssDNA,ssRNA

Exonuclease
3’→5’ssDNA

Exonuclease
3’→5’dsDNA

最終生成物

5’-P Mononucleotide
5’-P Oligonucleotide

5’-P Mononucleotide
5’-P Oligonucleotide

5’-P Mononucleotide

ssDNA
5’-P Mononucleotide

分子量

32,000

39,000

52,140

28,000

最適pH

4.5

5.0

9.5

8.0

金屬離子

Zn2+

Zn2+

Mg2+

Mg2+

 

BAL 31 Nuclease

Deoxyribonuclease I

Micrococcal Nuclease

Ribonuclease H

反應(yīng)特異性

Endonuclease ssDNA
Exonuclease 5’→3’
3’ →5’dsDNA

Endonuclease
ssDNA,dsRNA

Exonuclease
ssDNA,dsDNA,ssRNA

RNA-DNA Hybrid特異的Endonuclease

最終生成物

5’-P Mononucleotide

5’-P Oligonucleotide

3’-P Mononucleotide
3’-P Oligonucleotide

ssDNA
5’-P Oligonucleotide

分子量

73,000~83,000

31,000

16,800

21,000

最適pH

8.1

7.0

9.2

8.0

金屬離子

Ca2+,Mg2+

Ca2+,Mg2+

Ca2+

Mg2+,Mn2+

 
Q-2:各種核酸酶的使用注意事項?
A-2:

各種核酸酶的使用注意事項如下:
1. Mung Bean Nuclease:
雙鏈識別能力依賴于堿基序列,切點多為A↓pN及T(U)↓pN,特別是在A↓pN處完全分解,而對G及C的序列幾乎不分解。
與S1 Nuclease不同,不能切斷切口對側(cè)的鏈。
2. BAL 31 Nuclease:
請通過預(yù)備實驗探討適合的反應(yīng)條件,此時所要研討的項目包括:酶量、鹽濃度、反應(yīng)溫度(37~65℃)、DTT濃度(0.5~10 mM)。
a. 單鏈Endonuclease活性在反應(yīng)溫度從30℃降到20℃時,大約下降到1/10左右,而雙鏈Exonuclease活性大約殘留1/3左右。
b. Endonuclease活性不受鹽濃度影響,但Exonuclease則是鹽濃度越高活性越低。
c. Trimming活性的最適鹽濃度為NaCl 200 mM左右,若低于此濃度有時表現(xiàn)Nicking活性。
d. 分解活性對堿基的依存性較高,由于GC rich領(lǐng)域(特別是Sma I site)不易被分解,在酶切時,有必要選擇末端限制酶位點。
e. 反應(yīng)中因各種酶活性的反應(yīng)分配(Distributive)關(guān)系,對酶濃度有較大的依存,所以對稀釋不表現(xiàn)線性關(guān)系。當(dāng)酶反應(yīng)速度過快時,與其降低酶量,不如降低反應(yīng)溫度。
f. 本酶需要Ca2+的存在,通過使用螯合劑可使其不可逆失活。在NaCl濃度為1 M左右時,該酶對于單鏈DNA表現(xiàn)出最大活性。相反對于雙鏈DNA,其活性則隨著鹽濃度的增加而降低。當(dāng)鹽濃度在100 mM以下時,有時會發(fā)生隨機分解。因此,建議在鹽濃度200~600 mM的范圍內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。
g. 通過本酶產(chǎn)生的末端的平滑率只有10%左右,為了提高連接效率,建議通過T4 DNA Polymerase進(jìn)行修復(fù)。
3. Exonuclease III:
a. 反應(yīng)在37℃時受各種活性的分配影響(Distributive),但在23℃時,如果酶量充分,基本上能以一定的速度分解。
b. 該酶在性質(zhì)上有這樣一個特點:DNA即使具有3’突出末端,有時也因其末端及序列的不同而被作為底物降解。例如:
一個堿基突出型(Eam1105 I等)
二個堿基突出型(Pvu I、Sac II等)
三個堿基突出型(Sfi I等)
四個堿基突出型(Apa I被確認(rèn),Ban II及BstX I也有可能)
4. Micrococcal Nuclease:
本酶的活性嚴(yán)格依賴于Ca2+的存在,用EDTA或EGTA可以終止反應(yīng)。
5. Deoxyribonuclease I:
a. 本酶最適pH值為中性附近,穩(wěn)定pH值為5~6。
b. 80℃、10分鐘熱處理后,可使其不可逆失活。

Q-3:末端平滑時S1 Nuclease與Mung Bean Nuclease的區(qū)別?
A-3:

一般認(rèn)為,末端為GC時Mung Bean Nuclease易發(fā)生堿基殘留,而S1與之相反易發(fā)生切入(Nibbling)現(xiàn)象,根據(jù)DNA末端的不同而區(qū)分使用為宜(末端富含GC時使用S1,但應(yīng)注意反應(yīng)時間,不要發(fā)生切入現(xiàn)象。除此之外使用MB)。但不管哪種酶,在反應(yīng)后用T4 DNA Polymerase處理后,DNA末端平滑的效率都會提高。

Q-4:Mung Bean Nuclease作用后DNA電泳條帶模糊,是切入(Nibbing)了嗎?
A-4:

Mung Bean Nuclease基本上不發(fā)生切入現(xiàn)象。請在10~50 U/μg DNA,25℃,15min的條件下進(jìn)行反應(yīng)。在30 U,37℃,10 min以上的條件下有時可能會發(fā)生非特異性分解。另外,在用Mung Bean Nuclease處理DNA之前使用Exo III時,在DNA上如有切口,Exo III將從切口處作用。因此,需要確認(rèn)是否是無切口的完好的DNA。

Q-5:在BAL 31 Nuclease的反應(yīng)液中,加入了600 mM的高濃度NaCl,對反應(yīng)有沒有影響?
A-5:

由于BAL 31 Nuclease是海洋細(xì)菌由來的酶,即使在高鹽濃度下也能充分地顯示活性。分別在60 mM、200 mM、600 mM NaCl下比較Exonuclesae活性,幾乎沒有差別。60 mM與600 mM相比,也只是在60 mM條件下的酶活性高2~3倍左右。由于在60 mM NaCl條件下,容易因Nicking活性而發(fā)生鏈內(nèi)裂解,因此,不適于使用低鹽濃度。而在600 mM NaCl條件下分解速度適當(dāng),在使用上完全沒有問題。

Q-6:BAL 31 Nuclease對Nick(切口)作用嗎?
A-6:

BAL 31 Nuclease對Nick(切口)作用,但程度較低。

Q-7:Micrococcal Nuclease的反應(yīng)體系是什么?
A-7:

使用例
DNA的片段化
1. 在微量離心管中配制下列反應(yīng)液。

DNA 100   μg
10×Micrococcal Nuclease 5   μl
Micrococcal Nuclease 2   U
dH2O Up to 50   μl

2. 37℃反應(yīng)數(shù)分鐘(通過預(yù)實驗確定具體反應(yīng)時間)。
3. 加入5 μl的200 mM EGTA(或EDTA)停止反應(yīng)。
4. 加入5 μl(1/10量)的3 M NaOAC(pH5.2)。
5. 加入125 μl(2.5倍量)的冷無水乙醇,-20℃放置30~60分鐘。
6. 離心回收沉淀,用70%的冷乙醇清洗沉淀,真空干燥。

Q-8:只想從末端除去幾個核苷酸時,用通常的反應(yīng)條件切過了怎么辦?
A-8:

使用BAL 31 Nuclease時,降低反應(yīng)溫度(20℃時大約為30℃時的1/3活性),或Exonulease III和S1 Nuclease組合使用。

Q-9:Exo III作用于DNA后進(jìn)行Agarose電泳時,出現(xiàn)電泳帶模糊,是非特異性的Nuclease污染嗎?
A-9:

Exo III也作用于Nick。用限制酶切斷DNA時,如果酶過量或使之長時間反應(yīng)時,由于Star活性有時會使DNA產(chǎn)生切口。

Q-10:Recombinant DNase I (RNase-free)的使用注意事項?
A-10:

通常使用Recombinant DNase I (RNase-free)來分解體外轉(zhuǎn)錄后的模板DNA和去除RNA中的基因組DNA,反應(yīng)后都要經(jīng)過苯酚抽提。
Recombinant DNase I (RNase-free)的RNase Free是相對的,如果不是必要的話,可以不去除RNA中的gDNA,而是通過設(shè)計引物來避免擴增gDNA模板,同時做負(fù)對照(不加反轉(zhuǎn)錄酶)來檢驗實驗結(jié)果。如果必須去除gDNA,一定要使用RNase Free 的DNase I。

Q-11:使用DNA Topoisomerase I要注意哪些問題?
A-11:

使用DNA Topoisomerase I要注意以下問題:
1. pBR322 DNA和φX174 DNA的RF I(超螺旋分子)用DNA Topoisomerase I反應(yīng)后電泳,膠中含溴乙錠(EtBr)時,反應(yīng)前后DNA帶的位置不發(fā)生變化。這是因為由DNA Topoisomerase I作用而轉(zhuǎn)換為松散型的DNA受EtBr的影響,再次變?yōu)槌菪隣顟B(tài)。因此,使用Topoisomerase I反應(yīng)后,一般使用不含EtBr的瓊脂糖凝膠電泳,電泳終了后再用EtBr染色。
2. 如果在10×添附Buffer中直接加入0.1%小牛血清白蛋白溶液,會產(chǎn)生大量的白色沉淀。因此,在反應(yīng)液調(diào)制時需按以下順序添加試劑:
dH2O→10×反應(yīng)緩沖液→0.1% BSA→底物DNA

頁面更新:2020-04-27 14:04:59