可以根據(jù)所需濃度計(jì)算使用洗脫液的體積，一般情況下，洗脫液體積大于30 μl即可洗脫Column上90%以上的DNA（但要注意洗脫液需直接加至膜中央），所以洗脫液體積最好大于30 μl，當(dāng)對(duì)DNA濃度要求較高時(shí)，也可以適當(dāng)減少洗脫液體積至20 μl，但回收率會(huì)略有下降，應(yīng)注意使用預(yù)熱的洗脫液洗脫，并在洗脫離心之前靜置1分鐘以上，以提高洗脫效率。
本試劑盒中Column一次回收的最大吸附量可達(dá)20 μg以上，最小DNA起始量也可低至500 ng，所以使用前請(qǐng)對(duì)DNA樣品的總量進(jìn)行估算。
一般情況下，DNA的回收率可以達(dá)到50-80%。DNA收量較低時(shí)，可以從以下幾個(gè)方面考慮：
① 膠塊體積過大，單個(gè)Column可以承載的凝膠體積最好小于300 mg，大于300 mg的凝膠，請(qǐng)使用多個(gè)Column進(jìn)行回收，否則收率較低。
② 使用前確認(rèn) Buffer WB中是否加入了指定體積的乙醇。
③ 融膠未完全。融膠時(shí)注意觀察膠塊是否完全融解，膠塊未完全融解會(huì)嚴(yán)重影響收量。融膠時(shí)，間斷顛倒混勻融膠液有助于膠塊的快速融解。
④ 融膠液pH值過高。融膠后注意觀察融膠液的顏色，若融膠液的顏色由黃色變?yōu)槌壬蚍凵砻魅谀z液的pH值過高，會(huì)造成DNA收量較低，此時(shí)應(yīng)向融膠液中加入10 μl 3 M醋酸鈉（pH5.2）,混合后至融膠液顏色變回黃色時(shí)，再將融膠液轉(zhuǎn)移至Column上進(jìn)行后續(xù)操作。
⑤ 使用離心方法時(shí)，注意要在常溫下離心，使DNA更好地和Column上的膜結(jié)合。
⑥ 洗脫前的空離步驟不可省略，此步驟可以除去Column上殘留的洗液中的乙醇，否則影響洗脫效率。
⑦ 洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至60℃后使用有利于提高洗脫效率。
當(dāng)DNA片段長度較長（10 kb以上）時(shí)，回收效率會(huì)有所下降，這是DNA切膠回收時(shí)的常見現(xiàn)象。此時(shí)建議按以下方法解決問題：
① 適當(dāng)增加待回收DNA樣品的添加量（如起始量加至2～5 μg）。
② 由于長片段DNA不易從濾膜上洗脫下來，建議使用加熱至60℃的Elution Buffer洗脫DNA，可以提高回收效率。
③ 減少操作過程中對(duì)長片段DNA的物理損傷：如振蕩混合操作不要過于劇烈，切膠時(shí)不要將DNA長時(shí)間暴露于紫外燈下，在進(jìn)行電泳時(shí)可以使用6×Quadricolor-loading Buffer（Code No. 9171）判斷核酸的遷移情況，避免使用紫外燈反復(fù)照射觀察核酸遷移情況。
① 洗脫液中殘留部分鹽離子，加入Buffer WB后室溫靜置5分鐘，有助于徹底清洗掉Column上殘留的鹽離子。
② 洗脫液中殘留乙醇，在向Column中加入洗脫液之前，將Column在室溫下靜置2分鐘有助于使Column上殘留的乙醇徹底揮發(fā)，然后再加入洗脫液洗脫。
③ 進(jìn)行DNA洗脫時(shí)用滅菌蒸餾水或Elution Buffer洗脫。
頁面更新：2020-04-28 14:45:40
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