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產(chǎn)品選擇指南

技術服務信息

當前位置：首頁 > 技術資料 > 相關問答 > Takara > 核酸提取純化及DNA標記 > TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0
Q-1：純化質粒DNA時，一般使用多少菌體培養(yǎng)液比較合適?
A-1：

根據(jù)我們的經(jīng)驗，如為高拷貝質粒（如：pUC118等），使用2 ml培養(yǎng)液與4 ml培養(yǎng)液純化的質粒DNA的收量差別不是很大，可以純化10～15 μg高純度質粒DNA。我們一般使用2 ml的菌體培養(yǎng)液進行質粒DNA提取。

Q-2：本試劑盒對低拷貝質粒的純化提取情況如何?
A-2：

對于低拷貝質粒，使用4 ml的菌體培養(yǎng)液進行質粒DNA的提取比較合適。如使用pBI121質粒時，從4 ml的菌體培養(yǎng)液中，可以純化提取2～3 μg的高純度質粒DNA。若質粒量仍不夠可以多次提取后混合使用。

Q-3：質粒DNA的收量較低，為什么?
A-3：

一般情況下，從2 ml的LB培養(yǎng)基進行過夜培養(yǎng)的pUC118/JM109培養(yǎng)液中，可以純化約10 μg高純度質粒DNA。質粒DNA收量較低時，可以從以下幾個方面考慮：
① 大腸桿菌太陳舊（低溫下長期保存的菌等）。請涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進行液體培養(yǎng)。
② 質?？截悢?shù)低。使用低拷貝數(shù)載體時，每次產(chǎn)出的質粒DNA量會降低。
③ 確認操作過程的嚴密性。應嚴格按操作方法進行操作。
④ 洗脫時將滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至60℃后使用有利于提高洗脫效率。

Q-4：加入Solution Ⅱ后的溶菌液不澄清，為什么?
A-4：

① 菌體量過多，不能充分溶菌。使用本試劑盒時，每次可處理的菌體培養(yǎng)液為1～4 ml，菌體量過多時，需要按照比例增加Solution I\II\III的加量。
② 菌體沉淀懸浮不充分。在加入Solution Ⅰ后，應使用振蕩器（Vortex）等進行劇烈振蕩使菌體沉淀充分懸浮后再做溶菌處理。

Q-5：質粒DNA測序結果不佳，為什么?
A-5：

① 模板DNA加量不準。請對質粒DNA正確定量。使用吸光度值定量時，有時DNA溶液中的不純物會影響吸光度值的測定，此時建議使用瓊脂糖凝膠電泳法進行定量。
② 質粒DNA純度不好。請嚴格遵守實驗操作要求，使用新鮮菌體培養(yǎng)液提取質粒。
③ 進行DNA洗脫時用滅菌蒸餾水洗脫。
④ DNA插入片段本身立體結構復雜。有些DNA立體結構復雜（如GC rich、重復序列等）時難以測序，應改進測序方法。

Q-6：質粒DNA的最小洗脫體積是多少?
A-6：

我們建議的洗脫體積為30-100 μl，此種洗脫體積下收率最佳（但要注意洗脫液需直接加至膜中心），低于30 μl時收率會有所下降，當對質粒DNA濃度要求較高時，也可以減少洗脫液體積至20 μl，但回收率會略有下降，應注意使用預熱的洗脫液洗脫，并在洗脫離心之前靜置1分鐘以上，以增加洗脫效率。

Q-7：提取得到的質粒有基因組DNA污染，為什么?
A-7：

① 加入Solution II后所有的振蕩要輕柔，不可劇烈；
② 加入Solution II后裂解時間不宜過長，不可超過5分鐘；
③ 提取的菌體培養(yǎng)時間不可過長，培養(yǎng)12-16小時為宜。

Q-8：提取得到的質粒有RNA污染，為什么?
A-8：

① 確保Solution I中已經(jīng)加入了RNase A；
② 加入RNase A的Solution I應于4℃保存，若保存超過3個月，RNase A活性會下降，可以重新額外添加RNase A（Code No．2158）。

頁面更新：2020-04-28 15:20:04