如果使用該試劑盒出現(xiàn) RNA Spin Column堵塞現(xiàn)象，原因可能有以下幾種：
1．樣品裂解不充分。樣品裂解不充分會(huì)導(dǎo)致RNA Spin Column的堵塞。關(guān)于組織或細(xì)胞的裂解請(qǐng)參見(jiàn)操作方法中的組織或細(xì)胞的裂解。難裂解的組織建議使用液氮研磨的方法進(jìn)行裂解。
2．樣品起始量過(guò)多。樣品量過(guò)多會(huì)造成核酸量過(guò)多而發(fā)生堵塞現(xiàn)象。使用該試劑盒提取的組織或細(xì)胞的最佳起始量，請(qǐng)參考“不同組織的最佳起始量和裂解Buffer RL使用量”。
3．離心溫度過(guò)低。使用該試劑盒進(jìn)行RNA提取時(shí)，如無(wú)特殊說(shuō)明均在室溫（20～25℃）下進(jìn)行。溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)RNA Spin Column造成影響，發(fā)生堵塞現(xiàn)象。
對(duì)于基因組含量較高或者樣品起始量較大時(shí)，請(qǐng)不要使用gDNA Eraser Spin Coumn，以免gDNA Eraser Spin Column 發(fā)生堵塞。如果樣品量較少或基因組含量較少也發(fā)生堵塞現(xiàn)象，則可能的原因是：
1．樣品裂解不充分。樣品裂解不充分會(huì)導(dǎo)致Column的堵塞。關(guān)于組織或細(xì)胞的裂解請(qǐng)參見(jiàn)操作方法中的組織或細(xì)胞的裂解。難裂解的組織建議使用液氮研磨的方法進(jìn)行裂解。
2．樣品起始量過(guò)多。樣品量過(guò)多會(huì)造成核酸量過(guò)多而發(fā)生堵塞現(xiàn)象。使用該試劑盒提取的組織或細(xì)胞的最佳起始量，請(qǐng)參考“不同組織的最佳起始量和裂解Buffer RL使用量”。
3．離心溫度過(guò)低。使用該試劑盒進(jìn)行RNA提取時(shí)，如無(wú)特殊說(shuō)明均在室溫（20～25℃）下進(jìn)行。離心轉(zhuǎn)數(shù)過(guò)低。如發(fā)生堵塞的現(xiàn)象，可以加大離心轉(zhuǎn)數(shù)以及離心時(shí)間。
如果 gDNA Eraser Spin Column 發(fā)生堵塞，則：
1．將樣品吸出后直接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2．增加離心次數(shù)和時(shí)間。
3．增大離心轉(zhuǎn)數(shù)。
4．如果是基因組較多或起始量較大，不要進(jìn)行g(shù)DNA Eraser Spin Column的過(guò)濾。
使用該試劑盒提取的組織或細(xì)胞的收量請(qǐng)參考“不同組織的RNA提取量”。如果RNA的收量過(guò)低，則可能有以下幾種原因：
1．樣品裂解不充分。樣品的充分裂解是使用該試劑盒提取高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵。關(guān)于樣品的裂解請(qǐng)參考操作方法中的組織或細(xì)胞的裂解。
2．樣品起始量過(guò)多。使用該試劑盒提取的組織或細(xì)胞的最佳起始量，請(qǐng)參考“不同組織的最佳起始量和裂解Buffer RL使用量”。
3．RNA洗脫不充分。建議重復(fù)洗脫RNA一次。洗脫時(shí)可以將RNase Free dH2O或0.1% DEPC dH2O在RNA Spin Column 中的靜置時(shí)間延長(zhǎng)至10 分鐘。
4．洗脫液中有乙醇?xì)埩簟Ｔ谑褂肂uffer RWB進(jìn)行RNA Spin Column清洗后沒(méi)有進(jìn)行后續(xù)的離心過(guò)程，造成乙醇?xì)埩?，使RNA的收量下降。建議在使用Buffer RWB清洗后再進(jìn)行一次離心，以去除殘留的乙醇。
如果提取時(shí)發(fā)生降解，則可能有以下幾種原因：
1．使用的組織材料不夠新鮮。應(yīng)使用新鮮的組織材料，或?qū)⑿迈r的組織材料用液氮迅速冷凍后置于-80℃保存。
2．提取RNA時(shí)使用的試劑及器具中混有RNA分解酶。實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)參考“預(yù)防RNase污染的注意事項(xiàng)”，以避免RNase 污染。
3．提取的組織材料中含有大量RNA分解酶。RNA分解酶較多的組織或細(xì)胞應(yīng)當(dāng)減少樣品起始量，并加大Buffer RL用量。
本試劑盒提供了去除基因組DNA的gDNA Eraser Spin Column，能夠很好地去除材料中的基因組DNA，一般不會(huì)含有基因組DNA的污染。如果提取的RNA中含有基因組DNA污染，則可能有以下幾種原因：
1．樣品裂解不充分。樣品不充分裂解會(huì)造成基因組DNA的殘留。樣品的裂解方法請(qǐng)參考操作方法中的組織或細(xì)胞的裂解。
2．樣品起始量過(guò)多。過(guò)多的起始量使得核酸含量過(guò)多，超過(guò)gDNA Eraser Spin Column的承載量，造成基因組DNA殘留。請(qǐng)參考“不同組織的最佳起始量和裂解Buffer RL使用量”。
3．樣品的基因組DNA含量過(guò)高。不同組織中基因組DNA的含量不同，對(duì)于基因組DNA含量較高的樣品，請(qǐng)減少樣品起始量，并增加提取時(shí)Buffer RL的用量。
4．未進(jìn)行DNase I的消化處理。對(duì)于部分基因組DNA含量較高的組織材料或后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA純度要求比較嚴(yán)格，則需進(jìn)行DNase I的消化處理。請(qǐng)參考操作方法，進(jìn)行DNase I的消化處理。
有關(guān)RNA的吸光度說(shuō)明如下：
260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白質(zhì)等有機(jī)物的吸光度值。OD260/OD280（R）體現(xiàn)了RNA中的蛋白質(zhì)等有機(jī)物的污染程度，質(zhì)量較好的RNA的R值應(yīng)在1.8～2.0之間，當(dāng)R<1.8時(shí)，溶液中蛋白質(zhì)等有機(jī)物的污染比較明顯；當(dāng) R>2.2時(shí)，說(shuō)明RNA已經(jīng)被水解成了單核苷酸。
在對(duì)核酸進(jìn)行吸光度檢測(cè)時(shí)，需要注意稀釋液應(yīng)使用TE Buffer。
RNA的濃度可以根據(jù)吸光度進(jìn)行計(jì)算：
RNA濃度=（OD260-OD320）×稀釋倍數(shù)×0.04 μg/μl 。
使用本試劑盒能夠有效提取分子量大于200 nt的RNA。對(duì)于分子量小于200 nt的RNA，使用本試劑盒不能很好地提取。
本試劑盒只能進(jìn)行簡(jiǎn)單的基因組DNA提取?；蚪MDNA的收量相對(duì)較低，可以進(jìn)行簡(jiǎn)單的PCR擴(kuò)增。當(dāng)材料的基因組DNA不易提取、基因組DNA含量較低或者后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)基因組DNA要求較高時(shí)，請(qǐng)選用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（Code No. 9765）進(jìn)行提取，本試劑盒不承諾提取效果。
裂解組織時(shí)，可以根據(jù)不同組織材料采取不同的裂解方式，如液氮研磨、組織勻漿器、組織破碎儀（NEXT ADVANCE BBX24B）、電動(dòng)研磨器BioMasher（nippi）、一次性組織研磨杵等。一般的動(dòng)物組織，如肝臟、胰臟、腦等易于破碎的材料，使用本試劑盒，經(jīng)驗(yàn)證上述方法均適用，且RNA的收量及純度差別不明顯；但對(duì)于植物組織及肌肉等富含纖維的組織材料，仍建議客戶使用液氮研磨等較為劇烈、充分的破碎方法，以保證組織材料的充分裂解；當(dāng)組織材料量較少（不易獲得）時(shí)，建議客戶使用組織破碎儀（NEXT ADVANCE BBX24B）、電動(dòng)研磨器BioMasher（nippi）或一次性組織研磨杵等在裂解過(guò)程中不易丟失組織材料的裂解方法。
頁(yè)面更新：2020-04-30 10:30:08
|
使用規(guī)章丨聯(lián)系方式丨 關(guān)于個(gè)人信息的保護(hù)丨特別說(shuō)明
寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司
Copyright ? 2015 Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. All rights reserved. 京ICP備06030419號(hào)-1
京公網(wǎng)安備 110114000405號(hào)
