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機(jī)構(gòu)用戶解決方案

Q-1：可以從凍結(jié)細(xì)胞中提取片斷化DNA嗎?: A-1：
我們推薦從新鮮的培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行提取。但從本公司的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，進(jìn)行3次凍融處理的培養(yǎng)細(xì)胞也能提取檢出片斷化DNA，但收量明顯減少。

Q-2：提取的片斷化DNA的保存方法和穩(wěn)定性怎樣?: A-2：
請(qǐng)將樣品分裝后在-20℃以下保存，盡量避免反復(fù)凍融。本公司的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：-20℃至少1個(gè)月穩(wěn)定；4℃保存時(shí)，至少7天穩(wěn)定。

Q-3：電泳結(jié)果中DNA片段模糊，得不到清晰的Ladder，原因是什么?: A-3：
可以考慮以下原因：
1. 細(xì)胞凋亡進(jìn)行過(guò)度，有非特異性的DNA片段。推薦提早取樣時(shí)間。
2. 操作中混入DNase。應(yīng)防止DNase混入（如實(shí)驗(yàn)戴手套等）。

Q-4：電泳結(jié)果無(wú)DNA片段檢出，為什么?: A-4：
可以考慮以下原因：
1. 沒(méi)有發(fā)生細(xì)胞凋亡。可使用In situ Apoptosis Detection Kit（Code No. MK500）等確認(rèn)細(xì)胞凋亡是否發(fā)生。
2. DNA量太少，無(wú)法檢出。增加處理樣品的細(xì)胞數(shù)或者盡可能使用少量的TE Buffer溶解提取樣品DNA。

Q-5：貼壁細(xì)胞用什么方法剝離細(xì)胞較好?: A-5：
用細(xì)胞刮勺剝離較好，與使用Trypsin剝離細(xì)胞方法相比，前者剝離的細(xì)胞的片斷化DNA Ladder較為清晰。

Q-6：10% SDS Solution低溫下產(chǎn)生沉淀，怎么辦?: A-6：
在40℃左右加熱，即可溶解。溶解后的溶液可以正常使用，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Q-7：6×Loading Buffer呈黃褐色，有無(wú)問(wèn)題?: A-7：
正常使用，6×Loading Buffer沒(méi)有問(wèn)題。

Q-8：ApopLadder Ex^™適用于哪些材料?: A-8：
適用于大部分培養(yǎng)細(xì)胞，也適用于其特性類似于培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞，比如使用BD Vacutainer^® CPT (Becton Dickinson)從全血或者脾中提取的淋巴細(xì)胞。但本試劑盒不適用于組織。

Q-9：以何種細(xì)胞作對(duì)照以驗(yàn)證提取成功?: A-9：
細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的DNA片斷化受以下因素影響：靶細(xì)胞、誘導(dǎo)劑及其濃度和誘導(dǎo)的時(shí)間等。另外，最近有報(bào)道說(shuō)產(chǎn)生了細(xì)胞凋亡也可能沒(méi)有產(chǎn)生DNA片斷化。該問(wèn)題沒(méi)有確切的答案。根據(jù)本公司的經(jīng)驗(yàn)，推薦使用1 mM星型胞菌素（Sigma，Code No. S4400）處理的HL60細(xì)胞作為驗(yàn)證提取成功的對(duì)照。
<使用HL60細(xì)胞實(shí)驗(yàn)例>
在90 mm培養(yǎng)皿中，加入10 ml培養(yǎng)基，接種10⁷個(gè)HL60細(xì)胞，然后加入星型胞菌素，使其終濃度為3 μM。在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)5小時(shí)^*，全量離心回收細(xì)胞。
用PBS(-) Buffer清洗一次后，使其懸浮于少量的PBS(-) Buffer中，將5×10⁶個(gè)細(xì)胞移入1.5 ml Microtube中，1,600×g室溫離心5分鐘。得到的片斷化DNA最終用20 μl TE Buffer溶解。取其中5 μl用3％ Agarose Gel電泳檢測(cè)。
*：細(xì)胞的不同培養(yǎng)狀態(tài)下星型胞菌素的作用效果也不同。圖1中的ladder是對(duì)星型胞菌素處理3～5小時(shí)得到的結(jié)果。

Q-10：片斷化DNA檢測(cè)時(shí)，使用哪種瓊脂糖凝膠，適合的濃度是多少?: A-10：
推薦使用3%的NuSieve^® 3:1 Agarose (Lonza Rockland)。

頁(yè)面更新：2020-05-11 15:55:22