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機(jī)構(gòu)用戶解決方案

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Q-1：RNA合成量少，怎么辦?: A-1：
（1）模板DNA混入RNase或者EDTA等。
→模板DNA進(jìn)行Proteinase K處理。
模板溶液中，加入終濃度為100 μg/ml的Proteinase K與終濃度為0.5％的SDS。37℃反應(yīng)30分鐘后，苯酚/氯仿處理、乙醇沉淀以及80%乙醇洗凈處理。
（2）模板DNA中含有NaCl。
→高濃度（＞30 mM）的NaCl使RNA Polymerase活性下降。進(jìn)行脫鹽操作（使用Spin Column或者再次進(jìn)行乙醇沉淀，80%乙醇洗凈處理2次）除去NaCl。
（3）模板DNA量少。
→制備的模板DNA，不僅需要測定吸光度（OD260），還需要電泳確認(rèn)，保證模板DNA用量準(zhǔn)確。
（4）反應(yīng)時間短。
→確認(rèn)反應(yīng)時間為1～2小時。根據(jù)模板DNA的不同，有必要適當(dāng)延長反應(yīng)時間。請嘗試反應(yīng)時間延長至4小時左右。

Q-2：可見到多個反應(yīng)產(chǎn)物，無目的產(chǎn)物的原因。: A-2：
（1）使用了能形成3′突出的限制酶。
→以質(zhì)粒DNA為模板時，線性化時如果形成3′突出末端，會合成很長的transcription RNA。不要使用形成3′突出的限制酶。
（2）質(zhì)粒線性化時酶切不完全。
→線性化樣品要電泳確認(rèn)。如果酶切不完全，請?jiān)俅芜M(jìn)行酶切處理。
（3）電泳時RNA形成二級結(jié)構(gòu)。
→in vitro transcription反應(yīng)合成的RNA通常使用非變性凝膠電泳。如果形成二級結(jié)構(gòu)，將出現(xiàn)比預(yù)想的條帶大或者兩條帶。這時請使用變性凝膠電泳；或者合成的RNA與變性Buffer（64％甲酰胺、26 mM MOPS，pH7.2、6.45 mM 醋酸鈉、0.6 mM EDTA）混合，65℃ 15分鐘處理后電泳可以消除RNA二級結(jié)構(gòu)的條帶。

頁面更新：2020-05-12 13:04:18