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Q-1：ThruPLEX Tag-seq Kit適用于什么類型的樣品？

A-1：

ThruPLEX Tag-seq Kit是用于以cell-free DNA和片段化的雙鏈DNA起始制備Illumina NGS的DNA文庫試劑盒。ThruPLEX Tag-seq能夠生成高GC覆蓋的多種文庫，1～50 ng DNA起始可以得到再現(xiàn)性好的測序結(jié)果。

Q-2：ThruPLEX Tag-seq Kit與其他的ThruPLEX Kit的主要區(qū)別是什么？

A-2：

ThruPLEX Tag-seq Kit包含特別設(shè)計的ThruPLEX Stem-Loop 接頭，該接頭中含有能夠識別各起始DNA片段的分子標簽UMT。每個試劑盒包含超過1,600萬種以上的分子標簽，用于在擴增前標記每條DNA片段，可以在文庫制備、目標富集和數(shù)據(jù)分析過程中追蹤DNA片段，從而能夠高靈敏度且高特異性的檢測低頻變異。

Q-3：分子標簽（UMT）的作用是什么？

A-3：

ThruPLEX Tag-seq文庫的制備過程中，為標記識別起始的DNA片段，在連接步驟中加入分子標簽（UMT）。具有不同UMT的測序reads代表不同的原始分子，具有相同UMT的測序reads是相同原始分子經(jīng)PCR擴增的結(jié)果。后續(xù)進行數(shù)據(jù)處理時將帶有相同UMT的測序reads分為一組，每一組稱為一個擴增家族，比較各擴增家族內(nèi)部的reads能夠去除擴增錯誤和測序錯誤，得到共有序列后能夠進一步提高變異檢出的準確度。

Q-4：ThruPLEX Tag-seq識別用分子標簽（UMT）有多少個？

A-4：

通過ThruPLEX Stem-Loop adaptor的連接，在每個ThruPLEX Tag-seq文庫DNA片段的兩端添加6堿基的隨機序列。每個6堿基的隨機序列有4⁶（4,096）個組合。DNA片段兩端的6堿基序列組合后，能夠得到1,600萬（4,096 × 4,096）個分子標簽，通過這些分子標簽?zāi)軌蜃R別Input DNA分子。

Q-5：檢測1％頻率的等位基因變異需要的DNA起始量？

A-5：

為實現(xiàn)所需的檢測靈敏度，需要制備含有足夠變異體拷貝數(shù)的文庫，此時適當?shù)腄NA起始量非常重要。通常情況下等位基因存在的頻率越低，所需的起始DNA量就越多。例如，假設(shè)10 ng的DNA樣品，含有足夠檢出1％等位基因所需的拷貝數(shù)。詳細請見ThruPLEX Tag-seq Kit操作說明書的C.III部分及下述表格。由于在文庫制備及靶標富集時DNA有損失，因此能夠檢出的拷貝數(shù)低于下表所列的數(shù)值。

Estimated Genome Copies Available for Library Preparation
CInput mount	Total Haploid Genome Copies^*	Total Variant Copies at Indicated Allele Frequency
CInput mount	Total Haploid Genome Copies^*	5％	1％	0.5％
50 ng	16,666	833	16,666	83
30 ng	10,000	500	100	50
10 ng	3,333	166	33	16
5 ng	1,666	83	16	8
1 ng	333	16	3	1

* Calculated using 3 pg as the mass of a haploid genome. The genomic complexity of plasma samples is highly variable. All numbers rounded down to nearest whole number.

Q-6：ThruPLEX Tag-seq文庫測序需要多大的深度（depth）？

A-6：

利用ThruPLEX Tag-seq文庫的分子標簽構(gòu)建共有序列，需要足夠的覆蓋度。通常情況下等位基因存在的頻率越低，檢出所需的測序深度越高。例如，目的峰擴增家族大小為每1分子10個reads，為確定變異最少需要3個分子的情況下，讀取等位基因頻率為5%的變異體至少需要600x的測序深度。同樣，等位基因變異頻率為1%突變體的確定至少需要3000x，等位基因變異頻率為0.5%則需要6000x的覆蓋度。詳細內(nèi)容請參考ThruPLEX Tag-seq Kit操作說明書的C.III部分及下表。
關(guān)于所需reads相關(guān)的內(nèi)容請見下述鏈接
https://www.takarabio.com/learning-centers/next-generation-sequencing/technology-and-application-overviews/sequencing-depth-for-smarter-thruplex-tag-seq

Estimated Mean Raw Sequencing Depth Required^*
Minimum number of Unique Molecules to Make a Variant Call	Allele Frequency
Minimum number of Unique Molecules to Make a Variant Call	5％	1％	0.5％
3	600x	3,000x	6,000x
5	1,000x	5,000x	10,000x
10	2,000x	10,000x	20,000x

* Raw sequencing depth includes all reads prior to removal of duplicates. This is calculated using a target peak amplification family size of 10 reads per unique molecule.
例如：1％ Allele Frequency，每個 unique molecule需要10個reads, 每個variant call需要3個 unique molecules時，（3/0.01）× 10＝3,000×的Coverage Sequencing Depth= (number of unique variants required to make a variant call/allele frequency)*approximate number of reads in each amplification family

Q-7：是否有與ThruPLEX Tag-seq Kit配套使用的靶標富集系統(tǒng)？

A-7：

有，ThruPLEX Tag-seq kit可與Agilent SureSelect、Roche NimbleGen SeqCap EZ、IDT xGen等主要的靶標富集制品搭配使用。靶標富集的protocol請見以下鏈接內(nèi)容：
https://www.takarabio.com/learning-centers/next-generation-sequencing/dna-seq-protocols

Q-8：ThruPLEX Tag-seq Kit合成的文庫是否可以與其他的Illumina NGS文庫在相同的lane中分析？

A-8：

可以，ThruPLEX Tag-seq文庫，可在同一個lane中與其他Illumina NGS用文庫一起測序。但是，需要在各樣品中預(yù)先加入不同的index，同時需要注意測序的覆蓋度要充足。利用分子標簽（UMT），ThruPLEX Tag-seq文庫經(jīng)靶標富集后通常需要使用較高的深度測序。

Q-9：ThruPLEX Tag-seq文庫得到的測序數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理？

A-9：

通過使用分子標簽（UMT）得到的ThruPLEX Tag-seq文庫的測序數(shù)據(jù)，首先要按照每個擴增家族分成組, 然后構(gòu)建共有序列。針對于ThruPLEX Tag-seq文庫的數(shù)據(jù)處理推薦使用以下2個專用數(shù)據(jù)分析的平臺：
·Curio
Curio是由Curio Genomics提供的基于云計算平臺。使用時，可簡單的將ThruPLEX Tag-seq文庫的測序數(shù)據(jù)上傳、處理及可視化。該平臺具有快速、用戶友好的界面和高效的alignment viewer。同時該平臺還配有模擬變異體檢出、分析及可視化過程的模型。詳細請見以下鏈接www.curiogenomics.com

·Connor
在GitHub（https://github.com/umich-brcf-bioinf/Connor）上有Connor版塊，是可以處理ThruPLEX Tag-seq文庫數(shù)據(jù)的開放型生物信息分析工具。輸入alignment之后的BAM文件，處理UMT信息，之后生成含有共有序列的BAM輸出文件。輸出的BAM文件可用于如FreeBayes、VarScan2及GATK HaplotypeCaller等的variant caller工具。

Q-10：如果想利用身邊現(xiàn)有的生物信息分析Pipeline數(shù)據(jù)的話，應(yīng)怎樣處理從ThruPLEX Tag-seq文庫得到的測序數(shù)據(jù)？

A-10：

由于每個Pipeline均不相同，因此推薦使用ThruPLEX Tag-seq文庫處理用的開放型生物信息分析工具-Connor。如果想改變您現(xiàn)有的Pipeline，下述信息可能會對您有幫助。ThruPLEX Tag-seq文庫的兩端各帶有6堿基的識別用分子標簽（UMT）。UMT無論是從Read 1開始還是從Read 2開始讀取都是最初的堿基，然后是8～11個堿基的Stem序列，接下來是template DNA序列。文庫構(gòu)造的詳細信息請參考ThruPLEX Tag-seq Kit操作說明書。

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