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| CRISPR基因編輯技術(shù)將會(huì)是腫瘤治療領(lǐng)域的下一匹“黑馬”嗎？ |
| CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)有望成為腫瘤治療領(lǐng)域的下一匹“黑馬”。 |
| CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在針對(duì)特異位點(diǎn)的靶向腫瘤治療方面具有巨大潛力。人乳頭瘤病毒（HPV）基因E6和E7，通過(guò)破壞正常的細(xì)胞周期和腫瘤抑制功能來(lái)發(fā)揮抗細(xì)胞死亡的作用。Cas9介導(dǎo)的人乳頭瘤病毒E7癌基因的破壞，無(wú)論是體外還是體內(nèi)，會(huì)致使人乳頭瘤病毒誘導(dǎo)的癌變得到顯著抑制（Lao et al. 2018）［1］。 |
| CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤免疫治療中所顯現(xiàn)出的效果也較為樂(lè)觀(guān)，可以有效破壞腫瘤細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制。經(jīng)過(guò)修飾的嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞，可以有效提高對(duì)腫瘤的靶向性和破壞性。使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，可以對(duì)T細(xì)胞基因組進(jìn)行敲入修飾，成功構(gòu)建CAR-T細(xì)胞。Kagoya et al., 2018報(bào)道，通過(guò)抑制DOT1L，它是一種組蛋白H3賴(lài)氨酸79甲基轉(zhuǎn)移酶，可以減輕異體T細(xì)胞反應(yīng)［2］ |
| 2020年2月，《科學(xué)》雜志發(fā)表文章，美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)Carl H. June教授團(tuán)隊(duì)使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行了基因修飾用于腫瘤治療，公布了臨床試驗(yàn)結(jié)果。本文研究者使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除了T細(xì)胞中兩個(gè)內(nèi)源性T細(xì)胞受體編碼基因TCRα和TCRβ以及PD-1基因，使用慢病毒載體導(dǎo)入了靶標(biāo)抗原。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，經(jīng)過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)多次編輯的T細(xì)胞不僅是安全的，而且在體內(nèi)的持續(xù)時(shí)間更久，表現(xiàn)了持續(xù)的攻擊和殺死腫瘤的能力［3］。 |
| 2020年4月，《Nature Medicine》雜志在線(xiàn)發(fā)表文章，四川大學(xué)華西醫(yī)院中國(guó)科學(xué)家盧鈾教授團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在體外T細(xì)胞中編輯PD-1基因，經(jīng)體外T細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，再輸回非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）受試者，首次證明了該療法在NSCLC中的安全性和可行性。盧鈾教授團(tuán)隊(duì)在世界范圍內(nèi)最早開(kāi)展CRISPR/Cas9基因編輯人體試驗(yàn)。2016年7月，《Nature》雜志率先報(bào)道盧鈾教授團(tuán)隊(duì)計(jì)劃開(kāi)展首個(gè)CRISPR/Cas9基因編輯人體臨床試驗(yàn)，并于2016年10月進(jìn)行了首例受試者治療。時(shí)隔4年之后，終于等來(lái)了臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)公布，無(wú)疑令人興奮［4］。 |
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| Workflow for T-cell-based therapies |
| ● 有優(yōu)勢(shì)就有挑戰(zhàn) |
| 這些具有突破性的臨床試驗(yàn)結(jié)果，展示了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤治療中的潛力，為腫瘤所困患者帶來(lái)了希望。不過(guò)，盡管CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)顯示了巨大的應(yīng)用潛力，但是使用該技術(shù)進(jìn)行免疫治療研究的過(guò)程中，如何高效導(dǎo)入是一個(gè)非常大的挑戰(zhàn)，也就是說(shuō)通過(guò)什么樣的方式可以把Cas9核酸酶和單向?qū)NA（sgRNA）有效、安全而且盡可能低副作用地運(yùn)送到目標(biāo)細(xì)胞中，這是一個(gè)難題。 |
| ● 直面挑戰(zhàn)，逆行而上 |
| 面對(duì)如何將Cas9核酸酶和單向?qū)NA（sgRNA）有效、安全、正確地運(yùn)送到目標(biāo)細(xì)胞中，我們來(lái)看看這些科學(xué)家們是如何做的吧。 |
| Carl H. June教授團(tuán)隊(duì)和盧鈾教授團(tuán)隊(duì)，在使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行編輯的過(guò)程中，均使用了電穿孔方法，這種方法可以直接將Cas9-gRNA核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物導(dǎo)入T細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，而不需要借助病毒載體。 |
| 這就不得不提到，2018年加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）研究團(tuán)隊(duì)在《自然》雜志上發(fā)表文章，Alexander Marson教授和他的同事揭示了一種高效的T細(xì)胞改造方法，通過(guò)共電穿孔的方式將Cas9-gRNA核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物與雙鏈DNA(dsDNA)或單鏈DNA(ssDNA) HDR模板共同導(dǎo)入至目標(biāo)細(xì)胞。在這項(xiàng)研究中，使用了電穿孔方法而不是病毒傳遞的方式，最大限度地降低細(xì)胞毒性。利用這一方法，作者迅速糾正了T細(xì)胞中自體免疫相關(guān)的遺傳突變，這些T細(xì)胞來(lái)自于患有罕見(jiàn)的單基因遺傳病的同胞；同時(shí)通過(guò)這一方法對(duì)來(lái)源于健康供體的T細(xì)胞進(jìn)行了重編程，經(jīng)過(guò)重編程的T細(xì)胞在體外和體內(nèi)模型中都成功地靶向了癌細(xì)胞。作者在開(kāi)發(fā)這種非病毒的T細(xì)胞重編程方法時(shí)，不僅設(shè)計(jì)了一種更適合臨床應(yīng)用的解決方案，而且還將T細(xì)胞改造所需要的時(shí)間從數(shù)年或數(shù)月縮短到了數(shù)周，大大降低了成本，加快了發(fā)現(xiàn)的步伐，擴(kuò)大了發(fā)現(xiàn)的可能性。作者在Cas9：HDR模板比率和電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化上花費(fèi)了大量時(shí)間，單就這一點(diǎn)而言，在未來(lái)的許多年里可能會(huì)使研究界受益匪淺［5］。 |
| 在以上三項(xiàng)突破性研究中，科學(xué)家們都是通過(guò)電穿孔方法將Cas9-gRNA核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物導(dǎo)入至T細(xì)胞中進(jìn)行有效基因編輯的，所使用的Cas9核酸酶均為無(wú)標(biāo)簽重組Cas9蛋白質(zhì)。 |
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| 使用RNP進(jìn)行基因編輯的一般過(guò)程 |
| ● 技術(shù)優(yōu)勢(shì)和趨勢(shì) |
| 與質(zhì)粒載體和病毒載體導(dǎo)入方法相比，通過(guò)電穿孔等方法（也可以使用顯微注射或者轉(zhuǎn)染方法）直接導(dǎo)入Cas9-gRNA核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物進(jìn)行基因編輯，具有以下優(yōu)勢(shì)： |
| · 不使用Cas9基因，從而有效抑制由于基因殘留使Cas9持續(xù)表達(dá)造成的脫靶現(xiàn)象 · 不存在由于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)所引起的時(shí)間滯后，可實(shí)現(xiàn)快速有效的突變導(dǎo)入 · 不需要考慮每個(gè)靶向生物的啟動(dòng)子和密碼子 · 可以控制導(dǎo)入的Cas9蛋白質(zhì)的量 |
| 研究表明，直接使用核糖核蛋白復(fù)合物（RNP：“Cas9蛋白質(zhì)”和“向?qū)NA”的復(fù)合物) 進(jìn)行基因編輯，可有效降低脫靶效應(yīng)。RNP導(dǎo)入細(xì)胞后，會(huì)迅速激活DNA剪切活性，快速切斷靶標(biāo)序列。另外，RNP在細(xì)胞內(nèi)能夠快速分解，有效避免靶標(biāo)序列以外的相似序列被切斷，降低脫靶效應(yīng)。RNP可以通過(guò)電穿孔、顯微注射以及轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入至靶標(biāo)細(xì)胞［6］。 |
| Google Scholar檢索結(jié)果顯示，使用RNP進(jìn)行基因編輯的文章，我們發(fā)現(xiàn)無(wú)論使用哪種導(dǎo)入法（電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)染），相關(guān)文章數(shù)量都在逐年增加；以Cas9 “clinical trials”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，發(fā)表文章逐年上升，2019年發(fā)表文章數(shù)量已超過(guò)5,000篇；以GMP Cas9 “clinical trials”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，發(fā)表文獻(xiàn)相對(duì)較少，但也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。 |
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| ● 助力科研，提供專(zhuān)業(yè)服務(wù) |
| 關(guān)于無(wú)標(biāo)簽重組Cas9蛋白質(zhì)，Takara可以提供GMP級(jí)和研究級(jí)兩種級(jí)別，品質(zhì)高穩(wěn)定性好，讓您隨心應(yīng)對(duì)基礎(chǔ)科研和體外臨床應(yīng)用（僅限于研究），實(shí)現(xiàn)從研究到臨床試驗(yàn)（基于研究目的）的平穩(wěn)過(guò)渡。 |
| ■ GMP級(jí)別重組Cas9蛋白質(zhì) |
| Recombinant Cas9 Protein GMP grade（Code No. T230）按照日本厚生勞動(dòng)?。?ldquo;PFSB Notification No. 0709002，2008年7月9日”；PFSB=醫(yī)藥食品安全局）發(fā)布的以下指南進(jìn)行生產(chǎn)和測(cè)試：“Standards for Manufacturing Control and Quality Control, etc. of Investigational Products (Investigational products GMP)”。 |
| 本Cas9蛋白質(zhì)溶液成分經(jīng)過(guò)了優(yōu)化，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有良好的耐受性，可降低導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)所造成的細(xì)胞損傷。將此Cas9蛋白質(zhì)和gRNA制備的RNP復(fù)合物，通過(guò)電穿孔、顯微注射等方式導(dǎo)入至靶細(xì)胞進(jìn)行敲除實(shí)驗(yàn)，經(jīng)驗(yàn)證該Cas9蛋白質(zhì)溶液對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有良好的耐受性。 |
| · 不含人源或動(dòng)物源成分 · 不包含his標(biāo)簽序列，適用于多種不同應(yīng)用 · 與單向?qū)NA（sgRNA）形成RNP復(fù)合物，可通過(guò)電穿孔或者顯微注射方式導(dǎo)入 · 適用于不同細(xì)胞類(lèi)型和不同生物體進(jìn)行基因編輯 |
| 以下數(shù)據(jù)由京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究所（CiRA）臨床應(yīng)用研究部門(mén)主任研究員/特聘據(jù)點(diǎn)講師堀田秋津先生、以及堀田研究室博士研究員徐淮耕先生提供。堀田秋津先生和徐淮耕先生比較了Recombinant Cas9 Protein GMP grade與其它公司Cas9蛋白質(zhì)產(chǎn)品的性能。下圖中誤差線(xiàn)代表S.D.（標(biāo)準(zhǔn)偏差）。他們進(jìn)行了3組實(shí)驗(yàn)，分別將5 μg A公司Cas9、A公司Cas9突變體、B公司Cas9以及本公司Cas9和sgRNA（0.625 μg×2種）通過(guò)電穿孔方式導(dǎo)入至人iPS細(xì)胞中，分別或者同時(shí)敲除兩種細(xì)胞表面蛋白質(zhì)A（Gene A）、B（Gene B）。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面蛋白質(zhì)A和B的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)中，使用本公司Cas9獲得的敲除效率是最高的（下圖所示）。在不同的實(shí)驗(yàn)組中，本公司的GMP級(jí)別Cas9蛋白質(zhì)穩(wěn)定地展示出了高敲除效率。 |
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| * 比較結(jié)果來(lái)自于Takara Bio USA, Inc. |
| ■ GMP級(jí)別重組Cas9蛋白質(zhì) |
| Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl) （Code No. 632640/632641）來(lái)源于野生型釀膿鏈球菌，適用于CRISPR/Cas9基因編輯實(shí)驗(yàn)的研究級(jí)別重組Cas9蛋白質(zhì)溶液。 |
| · 高蛋白質(zhì)濃度，尤其適用于電穿孔導(dǎo)入方法 · 甘油含量低，對(duì)活體損傷更小 · 含有NLS（核定位信號(hào)），導(dǎo)入后迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核 · 與Guide-it Complete sgRNA Screening System（Code No. 632636）組合使用實(shí)現(xiàn)高效率的基因編輯 |
| 我們比較了不同公司Cas9產(chǎn)品在hiPS細(xì)胞中基因敲除效率。剪切后電泳條帶的強(qiáng)弱可以半定量估計(jì)發(fā)生基因編輯細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。Guide-it Recombinant Cas9（3 μg/μl）與Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit制備的sgRNA相結(jié)合，通過(guò)電穿孔的方法導(dǎo)入Cellartis hiPSC-18細(xì)胞，采用Guide-it Mutation Detection Kit（Code No. 631448）確認(rèn)突變導(dǎo)入效率，％即表示基因編輯效率。如圖所示，Guide-it Recombinant Cas9（3 μg/μl）在多數(shù)靶基因位點(diǎn)均顯示有效的基因編輯。檢測(cè)結(jié)果顯示，使用Guide-it Recombinant Cas9（3 μg/μl）對(duì)于本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的靶基因都可以實(shí)現(xiàn)有效的突變導(dǎo)入。 |
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| * 比較結(jié)果來(lái)自于Takara Bio USA, Inc. |
| 腫瘤一直都是困擾人類(lèi)健康的難題，腫瘤治療研究也是數(shù)年來(lái)的科學(xué)難題。雖然基因編輯技術(shù)應(yīng)用于腫瘤治療還需要攻克基因脫靶、安全性、有效性等方面的諸多問(wèn)題，但這些研究和臨床試驗(yàn)結(jié)果無(wú)疑是令人鼓舞的。希望有了基因編輯技術(shù)的加持，腫瘤治療研究可以有進(jìn)一步的突破，讓更多人類(lèi)無(wú)力抗?fàn)幍哪[瘤疾病從無(wú)望治療變成有望治愈。 |
| 正所謂，人生路上，步履不停，我們會(huì)一直向前走?？茖W(xué)家們不會(huì)停下致力于攻克腫瘤的腳步，Takara公司也將致力于不斷為科學(xué)家提供高品質(zhì)的研究工具，為生命科學(xué)研究和產(chǎn)業(yè)支援提供支持。 |
| 參考文獻(xiàn)： |
| ［1］ Lao Y. H. et al. HPV Oncogene Manipulation Using Nonvirally Delivered CRISPR/Cas9 or Natronobacterium gregoryi Argonaute. Adv. Sci. 1700540 (2018). ［2］ Kagoya Y. et al. DOT1L inhibition attenuates graft-versus-host disease by allogeneic T cells in adoptive immunotherapy models. Nat. Communications 9, 1915 (2018). ［3］ EA Stadtmauer et al., CRISPR-Engineered T Cells in Patients with Refractory Cancer. Science. (2020). ［4］ You Lu et al. Safety and feasibility of CRISPR-edited T cells in patients with refractory non-small-cell lung cancer. Nature Medicine. (2020). ［5］ Roth, T.L et al., Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nat. Lett. 559, 405–409 (2018). ［6］ Hendriks, WT. et al., Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions. Cell Stem Cell. 2016, 18(1): 53. |
頁(yè)面更新：2021-07-16 16:12:37
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