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技術(shù)服務(wù)信息

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單細(xì)胞TCR-Seq技術(shù)——更高效的TCR a/b 鏈配對分析
 
書接上回，這一篇我們來聊一聊“單細(xì)胞TCR-Seq”技術(shù)。
點擊下面的文章標(biāo)題，帶您快速回顧上一篇精彩介紹。
《50篇20分↑文章，網(wǎng)友：免疫組庫分析要火？！》
 
免疫組庫分析為何要用到單細(xì)胞測序技術(shù)？
 
下面的示意圖為我們展示了單細(xì)胞測序技術(shù)對于TCR-Seq而言的重要性：
 
通過對大量T細(xì)胞進(jìn)行TCR測序分析，有助于理解TCR免疫組庫的多樣性、TCR介導(dǎo)的抗原特異性識別，以及適應(yīng)性免疫的相關(guān)機(jī)制。然而，這樣的研究方式雖然可以完成大量T細(xì)胞群體中克隆型的表達(dá)和相對豐度分析，但是除了一些稀有的細(xì)胞群體外，大部分T細(xì)胞都沒有辦法獲得正確的受體鏈特異性配對信息。我們知道，無論T細(xì)胞還是B細(xì)胞，在發(fā)揮特異性識別作用時，需要受體鏈特異性配對，發(fā)揮功能。T細(xì)胞主要是α/β鏈配對，B細(xì)胞則是輕鏈與重鏈配對。
 
 
單細(xì)胞TCR-Seq技術(shù)正好可以為這個問題帶來一種完善的解決方案。對單個T細(xì)胞進(jìn)行測序，一方面可以直接獲得單細(xì)胞水平下克隆型的多樣性信息；另一方面也可以直接對α-β鏈配對信息進(jìn)行分析研究。為α-β受體鏈找到失散的“小伙伴”不再那么艱難！
在《50篇20分↑文章，網(wǎng)友：免疫組庫分析要火？！》中，我們介紹了“整合了SMART（Switching Mechanism at 5’end of RNA Template）與5’RACE”的免疫組庫NGS文庫制備技術(shù)，該技術(shù)“能顯著降低PCR偏差，確保結(jié)果反映的是樣本的真實情況。并且具有更高的on-target率，能降低測序成本。”接下來，將要介紹的兩種單細(xì)胞TCR-Seq方法均以該技術(shù)為基礎(chǔ)，融入更多的精心設(shè)計。讓我們一睹為快！
 
■ 1. 基于96孔板的建庫方法
SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit
該方法用于對分選到96孔板中的單個T細(xì)胞進(jìn)行TCR-Seq。整個流程中設(shè)置了多種對照，建立起嚴(yán)格的分析質(zhì)控體系。此外，精心設(shè)計過的混合測序策略，可以將整板的單細(xì)胞文庫混合后在同一個測序儀流動槽（lane）中進(jìn)行測序。
 
實驗孔板布局
孔板外的陰性/陽性對照組用于測序文庫的質(zhì)量評估，孔板內(nèi)的陰性/陽性對照孔用于克隆型鑒定分析時的閾值設(shè)定以及對潛在交叉污染的評估。嚴(yán)格的質(zhì)控只為更好的測序結(jié)果。
 
巧妙的SMART-Seq Indexed Oligo
為了以更經(jīng)濟(jì)的方式進(jìn)行文庫測序，通常會將多個文庫進(jìn)行標(biāo)簽標(biāo)記后混合上樣至測序儀。單細(xì)胞測序中涉及的文庫數(shù)量更多，對每個單細(xì)胞文庫做好標(biāo)記對下游數(shù)據(jù)分析工作而言至關(guān)重要。通過SMART-Seq Indexed Oligo，可以在轉(zhuǎn)錄本cDNA第一鏈合成時，為同一細(xì)胞來源的轉(zhuǎn)錄本添加相同“身份標(biāo)簽”—— cell barcode。這樣，孔板中同一列的8個細(xì)胞樣品都有了自己的“身份標(biāo)簽”，他們會被混成12組混合文庫進(jìn)行V(D)J區(qū)序列的擴(kuò)增，并添加上只屬于自己組內(nèi)的index標(biāo)簽序列。
 
完整的文庫結(jié)構(gòu)在這里 ↓↓↓
 
綠色的Smart Oligo和紅色的Indexed Oligo組成了“身份標(biāo)簽”——SMART-Seq Indexed Oligo。
我們通過下面一組針對CD4+ T細(xì)胞的實驗來看一下SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit性能表現(xiàn)到底如何。
分選到96孔板中的CD4+ T細(xì)胞參照實驗手冊標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行文庫構(gòu)建。使用Miseq測序儀進(jìn)行測序，雙端2×300 bp reads，600 cycles。測序數(shù)據(jù)分析中，8種SMART-Seq Indexed Oligo的拆分工作通過配套的 Human scTCR Demultiplexer軟件可輕松完成。軟件下載即用，無需安裝。進(jìn)一步的序列比對、克隆型分析通過開源軟件MiXCR完成。
 
（數(shù)據(jù)來源于Takara Bio USA, Inc.）
 
至少一條TCR鏈得到鑒定的比例是92%（81/88 孔），α/β克隆型的鑒定比例是65%（57/88孔），同時鑒定到 α 和 β 鏈的克隆型比例是73%（64/88孔）。
直接用于測序的文庫構(gòu)建流程、高效的混合測序策略、易用的數(shù)據(jù)分析軟件，SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit幫助您快速上手單細(xì)胞TCR-Seq，獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)！
什么？您說需要進(jìn)行大規(guī)模、高通量的單細(xì)胞TCR-Seq？看這里↓↓↓
 
■ 2. 基于ICELL8 cx單細(xì)胞分選系統(tǒng)的建庫策略
ICELL8 cx Human TCR a/b Profiling
ICELL8 cx系統(tǒng)通過向微孔芯片中分注微量液體完成單細(xì)胞分選和多種單細(xì)胞測序文庫的構(gòu)建工作。搭載的熒光成像系統(tǒng)幫助完成活的單細(xì)胞挑選。在一張微孔芯片上可以對超過1,000個單細(xì)胞同時進(jìn)行TCR測序文庫制備。
 
高通量單細(xì)胞分選系統(tǒng)——ICELL8 cx
 
 
該方法在微孔芯片中完成單細(xì)胞分選，以及cDNA第一鏈合成。SMART-Seq Indexed Oligo已經(jīng)預(yù)先固定在芯片的微孔中。這樣，同一個細(xì)胞來源的轉(zhuǎn)錄本cDNA可以方便、正確地佩戴上相同的“身份標(biāo)簽”。接下來，將轉(zhuǎn)錄本cDNA從芯片收集至離心管內(nèi)，進(jìn)行V(D)J區(qū)序列擴(kuò)增、測序接頭連接，即得到用于上機(jī)測序的單細(xì)胞TCR免疫組庫分析文庫。
 
我們通過一組實驗感受一下這一建庫策略的性能表現(xiàn)吧！
選擇T細(xì)胞、外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）兩種細(xì)胞類型，分選與文庫構(gòu)建操作參照實驗手冊標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。使用Miseq測序儀進(jìn)行測序，雙端2×300 bp reads，600 cycles。下機(jī)數(shù)據(jù)可以通過配套的ICELL8 scTCR Analyzer軟件進(jìn)行拆分，以及進(jìn)一步的結(jié)果分析。ICELL8 scTCR Analyzer軟件下載即用，無需安裝，圖形化界面使用十分友好，好評！（需要提前配置好Java和Python）
 
 
（數(shù)據(jù)來源于Takara Bio USA, Inc.）
 
44%的PBMCs檢測到了TCR轉(zhuǎn)錄本，其中αβ鏈配對比例占70%；75%的T細(xì)胞檢測到了TCR轉(zhuǎn)錄本，其中αβ鏈配對比例占63%。
單細(xì)胞TCR免疫組庫分析在提供豐富克隆型信息的同時，進(jìn)一步展示了受體鏈的配對信息。這可以幫助研究人員深入了解T細(xì)胞的異質(zhì)性、可塑性，分析配對方式對TCR抗原特異性識別的影響，設(shè)計治療性抗體等。Takara單細(xì)胞TCR-Seq產(chǎn)品引入更多的對照，在處理復(fù)雜樣品時可以幫助獲得更高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。輔以友好的數(shù)據(jù)分析軟件，讓新手也可以從容應(yīng)對。
 
通過兩期的推送，我們準(zhǔn)備了豐富的免疫組庫分析知識，希望能為您的研究帶來幫助。大家可以將我們的內(nèi)容添加“收藏”，隨時回顧復(fù)習(xí)～
 
單細(xì)胞免疫組庫研究策略
 
基于96孔板——Human scTCR profiling 策略
基于ICELL8 cx單細(xì)胞分選系統(tǒng)——Human TCR a/b profiling 策略
 
 

頁面更新：2020-08-20 14:55:39