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96孔板做克??？！我那驚人的實驗搭子
 
In Fusion Snap Assembly，無縫克隆的理想之選，在低背景下，簡單的操作，即可進(jìn)行無需酶切連接、準(zhǔn)確率達(dá)到95%的高效克隆。In-Fusion克隆系統(tǒng)的簡單性和準(zhǔn)確性，使其非常適合高通量克隆工作流程。
 
自動化移液系統(tǒng)（Liquid handling systems）減少了人工操作中產(chǎn)生的錯誤和操作時間，并提高了產(chǎn)量及可重復(fù)性。分子克隆是得益于這類平臺的基因工程技術(shù)之一，這類平臺被廣泛應(yīng)用于高通量基因組裝，如抗體發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)組學(xué)和寡核苷酸/基因合成等研究領(lǐng)域。
對于高通量平臺來說，基于PCR的無縫克隆由于其簡便性、準(zhǔn)確性和靈活性，優(yōu)于其他傳統(tǒng)的克隆方法（如酶切連接克隆或TA克?。Ｈ欢?，克隆試劑與特定移液系統(tǒng)的兼容性常常被忽視，而且實驗流程并非總是適配的。
目前我們已和Beckman以及Eppendorf進(jìn)行聯(lián)用，通過在Beckman以及Eppendorf 平臺上實現(xiàn)Takara Bio生物學(xué)研究試劑的自動化，研究人員將受益于簡化的工作流程、短暫的手動操作時間和更高的可重復(fù)性，從而提高實驗的準(zhǔn)確性和效率。
 
讓我們一起來看看具體的實驗例吧！
 
實驗例1
♦ 平臺
Beckman Coulter Life Sciences Biomek i7 Dual Hybrid Workstation
♦ 試劑
Takara Bio In-Fusion Snap Assembly Master Mix
♦ 應(yīng)用
Beckman使用96孔板進(jìn)行自動化克隆反應(yīng)
♦ 目的
將DNA 線性化片段 （3.7 kb）插入到Hind III酶切的pUC19線性化載體中 （2.7 kb）。
♦ 方法
目的序列通過PCR擴增，分別使用與線性化載體的5'和3'端同源的正向和反向引物。PCR產(chǎn)物純化后，使用Biomek i7 Dual Hybrid工作站將In-Fusion Snap Assembly反應(yīng)液分配到96孔板中。孵育后，克隆反應(yīng)液被轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布在選擇培養(yǎng)基上，以便進(jìn)一步分析（圖1）。
圖1 Biomek i7 Dual Hybrid工作站上的自動In-Fusion克隆工作流程示意圖
♦ 結(jié)果
Biomek i7 Dual Hybrid分注準(zhǔn)確，通過測試5μL和10μL兩種反應(yīng)體積來驗證In-Fusion克隆反應(yīng)的菌落數(shù)量和克隆準(zhǔn)確性。結(jié)果表明菌落數(shù)分別能達(dá)到700、800以上，且準(zhǔn)確性能達(dá)到90%以上（圖2）。
圖2 In-Fusion克隆反應(yīng)的菌落數(shù)量和克隆準(zhǔn)確性
 
實驗例2
♦ 平臺
Eppendorf epMotion® 5075t
♦ 試劑
Takara Bio In-Fusion Snap Assembly Master Mix
♦ 應(yīng)用
Eppendorf使用 96 孔和384孔板進(jìn)行自動化克隆反應(yīng)
♦ 目的
將DNA 線性化片段 （3.7 kb）插入到Hind III酶切的pUC19線性化載體中 （2.7 kb）。
♦ 方法
使用epMotion® 5075t將In-Fusion Snap Assembly反應(yīng)液分配到96或384孔板中。孵育后，克隆反應(yīng)液被轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布在選擇培養(yǎng)基上，以便進(jìn)一步分析（圖3）。
圖3 epMotion® 5075t工作站上的自動In-Fusion克隆工作流程示意圖
♦ 結(jié)果
Eppendorf分別對96孔和384孔板進(jìn)行實驗，epMotion可以同時處理5μL和 10μL的In-Fusion Snap Assembly的克隆程序，并成功分離移液和預(yù)混液。共得到40個陽性樣本測序結(jié)果，該結(jié)果顯示了>95%的克隆準(zhǔn)確率，表明利用epMotion進(jìn)行自動化液體處理，可以成功地進(jìn)行In-Fusion無縫克隆，而且不會影響該克隆技術(shù)的高準(zhǔn)確度。未克隆成功的菌落很少，且控制在非線性化載體的正常背景水平內(nèi)（表1，圖4）。
表1 不同移液方法和回收體積的菌落計數(shù)
 
圖4 使用 epMotion 進(jìn)行In-Fusion克隆反應(yīng)設(shè)置。兩種移液方法，分離式（標(biāo)記為“Separate”）和預(yù)混合（標(biāo)記為“Premix”）移液，使用 epMotion 建立 In-Fusion 反應(yīng)。圖形值是獨立的克隆反應(yīng)。誤差線顯示±標(biāo)準(zhǔn)偏差。準(zhǔn)確性由Sanger測序確定。
♦ 結(jié)論
上述兩個實驗案例證明了In-Fusion無縫克隆可以與Biomek i7 Dual Hybrid工作站和Eppendorf epMotion 系統(tǒng)輕松適配，且不影響我們對這項技術(shù)所期望的高準(zhǔn)確度和高效率。
 
具體優(yōu)勢如下：
· 可以讓研究者提高克隆成功率
· 可以通過縮小克隆反應(yīng)體積，來降低克隆試劑的前期成本
 
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克隆產(chǎn)品選擇指南
 
 

頁面更新：2024-02-19 11:36:38