| NGS用PCR酶如何選擇，優(yōu)質(zhì)文獻(xiàn)為您解惑 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 下一代測序技術(shù) (NGS) 的興起對生命科學(xué)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于不同物種的科學(xué)研究中。PCR擴(kuò)增是許多NGS文庫構(gòu)建的必要步驟。擴(kuò)增單一靶標(biāo)時(shí)，大部分PCR酶能夠完成，但很少有PCR酶能夠應(yīng)對“NGS PCR”帶來的挑戰(zhàn)，即無偏差擴(kuò)增不同大小和不同GC含量的靶標(biāo)。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 2024年4月，英國劍橋大學(xué)醫(yī)學(xué)院Wellcome Sanger研究所在《Microbial Genomics》期刊上發(fā)表了一篇名為《Identifying the best PCR enzyme for library amplification in NGS》的文章。文章中研究人員評測了市場上在售的20余種PCR酶，用于NGS文庫構(gòu)建，為短讀長和長讀長的NGS篩選出最適合的PCR聚合酶。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 測評結(jié)論： TaKaRa Ex Premier™ DNA Polymerase（Code No.RR370）是短讀長NGS文庫擴(kuò)增的優(yōu)選酶之一 Terra™ PCR Direct Polymerase Mix（Code No.639270）是長讀長NGS文庫擴(kuò)增的優(yōu)選酶之一 |
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| 接下來我們一起了解一下本篇文章的主要內(nèi)容。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 為什么要謹(jǐn)慎選擇用于NGS文庫擴(kuò)增的PCR酶？ | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 研究結(jié)果表明，在測序前，不同PCR酶在擴(kuò)增效率和均一性上存在明顯差異。進(jìn)一步證實(shí)了PCR可能是引入基因組數(shù)據(jù)中偏差的來源。所以PCR酶的選擇對于NGS文庫擴(kuò)增至關(guān)重要，特別是GC含量不均勻的模板，更加容易出現(xiàn)覆蓋率偏差。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1. 收量評價(jià)——降低循環(huán)圈數(shù)，降低偏差 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 被評價(jià)的PCR酶之間，其產(chǎn)量有比較大的差異。當(dāng)使用低擴(kuò)增效率的PCR酶時(shí)可能會(huì)帶來較低的產(chǎn)量，反應(yīng)過程則需要更多的PCR循環(huán)，結(jié)果的偏差會(huì)更突出。 使用TaKaRa Ex Premier擴(kuò)增1 ng模板，進(jìn)行 14個(gè)PCR循環(huán)后，結(jié)果的覆蓋均一性與500 ng模板的PCR-Free文庫的覆蓋均一性接近，即使在GC含量比較極端的模板中也是如此。 值得注意的是本研究中測試的基因組之一，是瘧原蟲基因組（AT含量接近100%），因?yàn)楦腥菊叽蠖嗍悄暧椎膬和?，只能采集到較少的血液樣本，因此通常只能獲得少量的DNA樣本。利用TaKaRa Ex Premier，僅1 ng模板，就可以獲得非常均勻的基因組覆蓋。 |
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| 2. 低覆蓋率指數(shù)評價(jià)——PCR酶的綜合擴(kuò)增能力 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 研究人員評價(jià)了不同PCR酶的低覆蓋率指數(shù)（Low Coverage Index，LCI）。 LCI越低，說明NGS結(jié)果的覆蓋率越高，測序深度越高。 有些PCR酶在特定基因組中表現(xiàn)較好，但TaKaRa Ex Premier在測評的所有基因組中，均表現(xiàn)了高覆蓋率和良好的覆蓋率均勻度。包括測試的百日咳桿菌、大腸桿菌、艱難梭菌、惡性瘧原蟲基因組以及人類基因組。 與PCR-Free方法構(gòu)建的文庫覆蓋率相比，TaKaRa Ex Premier等三種PCR酶的偏差最小，覆蓋率均勻度與PCR-Free方法構(gòu)建的文庫接近。 |
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| 3. 擴(kuò)增準(zhǔn)確性評價(jià)——PCR酶對SNP和indel的檢測靈敏度 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 將NGS測序結(jié)果與參考基因組序列和突變序列列表進(jìn)行比較，評價(jià)每個(gè)PCR酶的擴(kuò)增準(zhǔn)確性。 被評價(jià)的20余種PCR酶在微生物參考基因組中，SNP和indel檢測靈敏度最高的是TaKaRa Ex Premier等三種PCR酶。 TaKaRa Ex Premie以非常高的重現(xiàn)性復(fù)制了很多SNP和 indel位點(diǎn)，SNP檢測靈敏度達(dá)到了99.17%，indel檢測靈敏度達(dá)到了93.85%。 |
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| 4. 人類基因組擴(kuò)增評價(jià)——對龐大模板的擴(kuò)增能力 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 人類基因組測序，特別是用于學(xué)術(shù)和臨床結(jié)果的變異發(fā)現(xiàn)，是NGS的主要應(yīng)用之一。人類基因組比微生物基因組要大得多，也更加復(fù)雜。TaKaRa Ex Premie的測試結(jié)果表現(xiàn)出色，覆蓋范圍均勻 (低LCI)，SNP和Indel檢測靈敏度都比較高，優(yōu)于被評價(jià)的大多數(shù)PCR酶。。 在本研究中，研究人員還篩選出 Terra™ PCR Direct Polymerase Mix為長讀長NGS文庫構(gòu)建的優(yōu)選酶之一。 |
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| 另外，除了上述推薦的PCR酶外，Takara還有多款適用于NGS擴(kuò)增的PCR酶產(chǎn)品供您選擇! 例如在2014年，暨南大學(xué)和美國南加州大學(xué)的研究人員曾經(jīng)在Scientific Reports（Nature）期刊上發(fā)表了一篇名為《Long-range PCR in next-generation sequencing: comparison of six enzymes and evaluation on the MiSeq sequencer》的文章。文章中研究人員使用6種應(yīng)用于長片段擴(kuò)增的PCR酶，分別擴(kuò)增12.9 kb、9.7 kb和5.8 kb的目的片段。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase可以在相同的 PCR 反應(yīng)條件下擴(kuò)增出三個(gè)長度不同的靶標(biāo)，而其余5種PCR酶均需要調(diào)整PCR反應(yīng)條件才能夠擴(kuò)增出三個(gè)靶標(biāo)，并且PrimeSTAR® GXL的性價(jià)比也較高。因此研究人員最終選擇了PrimeSTAR® GXL進(jìn)行后續(xù)的NGS實(shí)驗(yàn)。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，研究人員使用PrimeSTAR® GXL擴(kuò)增了9名受試者的樣本基因組并進(jìn)行測序。最終發(fā)現(xiàn)，在相同的PCR反應(yīng)條件下，PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase可以擴(kuò)增絕大部分不同大小和Tm值的擴(kuò)增子。這也再次證明Takara PCR酶在NGS領(lǐng)域具有出色的性能。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 在未來，Takara Bio將持之以恒地運(yùn)用生命科學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)知識，不斷創(chuàng)新，為科研工作者提供高質(zhì)量、高性能的產(chǎn)品，共同開啟生命科學(xué)研究的新篇章！ | ||||||||||||||||||||||||||||||||
√ 對于粗提樣品、GC/AT rich、長鏈(～30 kb）等難擴(kuò)增模板均可順利擴(kuò)增，具備高成功率 √ α型酶具有良好的校正功能，能保持高保真性 √ 預(yù)混型試劑，并且在-20℃保存不凍結(jié)，可節(jié)省操作時(shí)間 詳細(xì)產(chǎn)品信息及實(shí)驗(yàn)例請點(diǎn)擊鏈接查看：TaKaRa Ex Premier™ DNA Polymerase |
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√ 高度敏感的DNA聚合酶，可直接使用動(dòng)物或植物組織、粗提裂解液進(jìn)行擴(kuò)增 √ 對于難以擴(kuò)增的模板（如GC含量大于70%）也能進(jìn)行很好的擴(kuò)增 詳細(xì)產(chǎn)品信息及實(shí)驗(yàn)例請點(diǎn)擊鏈接查看：Terra™ PCR Direct Polymerase Mix |
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√ 對于人類基因組DNA能夠進(jìn)行30 kb左右的長鏈擴(kuò)增 √ 可對應(yīng)GC rich，AT rich及高模板量，是一款兼具高通用性的高保真酶 詳細(xì)產(chǎn)品信息及實(shí)驗(yàn)例請點(diǎn)擊鏈接查看：PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase |
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| 【推薦用于NGS的PCR酶一覽表】 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
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頁面更新：2024-07-15 11:19:39
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