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qPCR技術(shù)介紹（三）——PCR反應(yīng)

PCR引物/探針的設(shè)計原則

引物設(shè)計的優(yōu)劣，是影響定量PCR實驗結(jié)果的重要因素之一。有些引物反應(yīng)性能差，可以通過反應(yīng)條件優(yōu)化得到改善，但大多數(shù)情況改善效果并不是很明顯，所以，預(yù)先設(shè)計反應(yīng)性能良好的引物尤為重要。

qPCR引物設(shè)計原則

除此之外，引物的長度、擴增片段長度以及基因組結(jié)構(gòu)等參數(shù)都要加以考慮，下表總結(jié)了引物設(shè)計原則，★號表示重要程度，★號越多，表示該參數(shù)越重要，設(shè)計時要優(yōu)先考慮。

采用熒光探針檢測法時，要同時考慮引物和探針的質(zhì)量。通常首先要尋找合適的探針位置，再進行引物的設(shè)計，然后再將引物和探針之間進行比對分析，應(yīng)該說設(shè)計上比采用熒光嵌合法更加困難和繁瑣。下表總結(jié)了探針設(shè)計原則，★號表示重要程度，★號越多，表示該參數(shù)越重要，設(shè)計時要優(yōu)先考慮。

通常可以使用引物設(shè)計專用軟件進行引物、探針的設(shè)計，如Primer Premier、Oligo 7等，也可以利用NCBI網(wǎng)站功能，無需下載軟件也可進行設(shè)計，并可以進行特異性的比對。

如果想省去自己設(shè)計引物的繁雜操作，在Takara合成qPCR引物/探針，Takara可以免費提供引物/探針的設(shè)計服務(wù)。

預(yù)實驗確認(rèn)引物性能

新設(shè)計合成的引物，首先必須進行預(yù)實驗，對反應(yīng)性進行確認(rèn)。

模板使用梯度稀釋的cDNA溶液即可，每個反應(yīng)加入相當(dāng)于Total RNA 1 pg、10 pg、100 pg、1 ng、10 ng、100 ng的cDNA，對PCR擴增效率、檢測靈敏度、無模板對照和gDNA來源的擴增4個方面進行確認(rèn)。

如果預(yù)實驗顯示，PCR擴增效率低或有引物二聚體等非特異性擴增時，需要對PCR條件進行優(yōu)化，優(yōu)化可以按下圖的順序進行。

如果條件優(yōu)化后結(jié)果仍無改善，必須重新設(shè)計引物。

一步法與兩步法的選擇

qPCR常用于對樣本中的DNA或RNA進行定量，在對RNA進行定量的時候，需要先進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT反應(yīng)），將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

Two Step RT-PCR反應(yīng)是將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和qPCR反應(yīng)分兩步進行；One Step RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進行。

Two Step RT-PCR反應(yīng)，可選擇Random Primer、Oligo dT Primer或基因的特異性引物進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后再將一部分反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液（cDNA）作為模板添加到Real Time PCR反應(yīng)液中。使用反轉(zhuǎn)錄引物時可以根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇最合適的反轉(zhuǎn)錄引物，如果選擇Random Primer或Oligo dT Primer，合成的cDNA可用于復(fù)數(shù)種類基因的檢測，cDNA溶液可以穩(wěn)定地長期保存，供以后解析使用。

One Step RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進行，操作簡單，污染幾率低。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需要使用基因特異性引物 (GSP)，即基因特異性PCR下游引物，因此，能夠?qū)μ囟ɑ蜻M行高感度檢出。

如何選擇

以前，Two Step RT-PCR的反應(yīng)性能占有優(yōu)勢，但近些年來由于對試劑盒的不斷改良，One Step RT-PCR也能夠?qū)崿F(xiàn)良好的反應(yīng)性能。
究竟采用何種方法，可根據(jù)實驗?zāi)康淖杂蛇x擇。例如，病毒、病原菌檢測，適合使用操作簡單的One-Step RT-PCR方法；基因表達(dá)解析等目的基因數(shù)多時，適合使用通用引物的Two Step RT-PCR方法；樣品數(shù)多時，Two Step RT-PCR的操作顯得過于繁雜，而One Step RT-PCR就很方便。
另外，One Step RT-PCR因使用基因特異性反轉(zhuǎn)錄引物，Total RNA的添加量即使很多，也能夠高效率反應(yīng)，所以，有利于低表達(dá)基因的檢出。

頁面更新：2023-03-30 16:30:56

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