| qPCR技術(shù)介紹（二）——RNA提取&反轉(zhuǎn)錄 |
| 一般進行定量PCR的目的，是為了進行mRNA的表達量分析，或者對RNA拷貝數(shù)進行定量，或者確定RNA病毒是否存在的定性分析，那么首先都需要進行反轉(zhuǎn)錄實驗，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。 本文為您介紹反轉(zhuǎn)錄實驗相關(guān)的一些基礎(chǔ)概念。 |
| 制備RNA的關(guān)鍵，一是要抑制細胞中的RNA分解酶，二是要防止所用器具及試劑中的RNA分解酶的污染。 在實驗中必須采取以下措施：戴一次性干凈手套；使用 RNA 操作專用實驗臺；在操作過程中避免講話等。通過以上辦法可以防止實驗者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。 |
| 【使用器具】盡量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，應(yīng)在使用前進行干熱滅菌（180℃，60 min）或使用DEPC水處理再高壓滅菌。 RNA實驗用的器具和儀器建議專門使用，不要用于其它實驗。 |
| 【試劑配制】用于RNA實驗的試劑，需使用RNA實驗用的一次性塑料容器盛裝，或使用上面方法處理過的玻璃容器盛裝。使用的無菌水需用0.1%的DEPC處理后進行高溫高壓滅菌。RNA實驗用的試劑和無菌水都應(yīng)專用，避免混用后交叉污染。 |
| RNA的純度會影響cDNA的合成量，所以在提取RNA后需要進行RNA純度和質(zhì)量檢測。 |
| 260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白質(zhì)等有機物的吸光度值。 OD260/OD280（R）體現(xiàn)了RNA中的蛋白質(zhì)等有機物的污染程度，質(zhì)量較好的RNA的R值應(yīng)在1.8～2.0之間。當R< 1.8時，溶液中的蛋白質(zhì)等有機物的污染比較明顯；當R>2.2時，說明RNA已經(jīng)被水解成了單核苷酸。 在對核酸進行吸光度檢測時，需要注意稀釋液應(yīng)使用TE Buffer。 |
根據(jù)OD260，可以計算提取的RNA濃度：
RNA濃度(μg/μL）= (A260-A320）×稀釋倍數(shù)×0.04 |
利用1%的瓊脂糖凝膠（含溴乙錠）電泳結(jié)果，對提取的Total RNA進行RNA完整性以及是否有基因組DNA污染的評價。
如果可以清晰觀察到兩條rRNA條帶（真核生物：28S和18S；原核生物：23S和16S），且其濃度比值大約為2:1，則RNA未降解。 若觀察到smear現(xiàn)象，則RNA已發(fā)生降解。 如果觀察到大于28S或23S的條帶，則樣品可能有基因組DNA污染，這時可以考慮使用DNase I處理。  |
| 本方法基于微流體技術(shù)，僅需要2-7 ng RNA用于分析，可以替代傳統(tǒng)的基于凝膠的分析方法。通過RNA Integrity Number (RIN)評估RNA樣品的完整性。除了評價RNA質(zhì)量外，這個自動化系統(tǒng)還可以很好地提供RNA濃度的估計值。 |
| 進行Two Step RT-PCR反應(yīng)時的反轉(zhuǎn)錄Primer，可使用Random Primer、Oligo dT Primer或Gene Specific Primer三種引物，它們與RNA模板互補結(jié)合的位置關(guān)系如圖所示，我們必須根據(jù)實驗?zāi)康膮^(qū)分使用。 |
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| 通?；虮磉_解析，Random Primer最適合。Random Primer能夠在mRNA全長范圍內(nèi)進行高效率反轉(zhuǎn)錄，所以目的片段在mRNA的任何位置都能很好地進行表達解析。 |
| 想從Poly (A) 尾開始反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時，使用Oligo dT Primer。但是如果目的片段距離Poly (A) 尾過遠，反轉(zhuǎn)錄效率將會降低。從Poly (A) 尾至目的片段擴增位置之間存在強二級結(jié)構(gòu)或mRNA有分解可能的時候，使用Oligo dT Primer要特別注意。 |
| 進行One Step RT-PCR反應(yīng)時，反轉(zhuǎn)錄引物只能使用基因特異性下游引物，而不能使用Random Primer和Oligo dT Primer。 利用Real Time RT-PCR進行基因表達解析時，將Random Primer和Oligo dT Primer混合使用效果更佳，不僅可以在mRNA全長范圍內(nèi)高效率反轉(zhuǎn)錄，還可以將mRNA二級結(jié)構(gòu)及mRNA分解的影響控制在最小限度。 |
| 提取的Total RNA中常?；煊谢蚪MDNA，而基因組DNA可以直接作為PCR模板進行擴增，造成解析結(jié)果不準確。 為了避免這種情況發(fā)生，我們可以采取兩種措施：① 引物設(shè)計時避免基因組DNA擴增；② 使用DNase I 處理除去基因組DNA。 |
| 引物設(shè)計時避免基因組DNA擴增 |
| 首先確認目的基因的基因組結(jié)構(gòu)，選擇跨越較長的內(nèi)含子。然后，在這個內(nèi)含子兩側(cè)的外顯子上分別設(shè)計上、下游引物。 Real Time PCR反應(yīng)時通常擴增的目的DNA片段長度都比較短，設(shè)置的條件也是適合短片段DNA的擴增，超過500 bp就很難擴增了。所以，當內(nèi)含子足夠長時，基因組DNA來源的擴增就不能發(fā)生。 |
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| 當內(nèi)含子較短時，可將其中一條引物設(shè)計在exon junction上，這樣，基因組DNA來源的擴增也不能發(fā)生。但是，此種方法不適合具有單個外顯子的基因、或者不具有內(nèi)含子的生物種以及基因組情報沒被解析的生物種等。 |
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| 使用DNase I 處理除去基因組DNA |
| 使用常規(guī)方法提取Total RNA后，再使用DNase I 分解混入的基因組DNA，最后進行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等純化Total RNA。或者使用能去除基因組DNA的反轉(zhuǎn)錄試劑進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Takara明星產(chǎn)品PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) （Code No. RR047）是可以除去基因組DNA的定量PCR專用反轉(zhuǎn)錄試劑，試劑盒中附帶gDNA Eraser，僅需42℃、2分鐘即可高效去除基因組DNA。 |
頁面更新：2023-03-30 16:31:20
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