為了準(zhǔn)確地進(jìn)行基因表達(dá)量分析，必須滿足只有cDNA作為模板檢出的先決條件，但Total RNA中常常混有基因組DNA，并可以直接作為PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行擴(kuò)增，因此會(huì)造成解析結(jié)果不準(zhǔn)確。為了避免這種情況發(fā)生，通常將檢測(cè)用引物設(shè)計(jì)在內(nèi)含子前后的外顯子上，使基因組DNA得不到擴(kuò)增。但是，此方法不適合具有單個(gè)外顯子的基因或兩個(gè)外顯子之間所跨的內(nèi)含子過(guò)小的基因，同時(shí)當(dāng)基因組上有偽基因存在時(shí)、或設(shè)計(jì)引物對(duì)基因組有非特異性擴(kuò)增時(shí)、以及基因信息沒(méi)被完全解析的生物種等也同樣不適合于本方法。在這種情況下，我們常常需要對(duì)Total RNA樣品進(jìn)行DNase I處理，以除去殘存的基因組DNA。而DNase I處理通常要進(jìn)行復(fù)雜的純化操作，同時(shí)會(huì)造成RNA的降解和損失。
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因組DNA進(jìn)行Real Time RT-PCR反應(yīng)的專用反轉(zhuǎn)錄試劑。Kit中使用了具有較強(qiáng)DNA分解活性的gDNA Eraser，通過(guò)42℃，2 min即可除去基因組DNA。同時(shí)由于反轉(zhuǎn)錄試劑中含有抑制DNA分解酶活性的組分，經(jīng)過(guò)gDNA Eraser處理后的樣品可以直接進(jìn)行15 min的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，因此，20 min內(nèi)即可迅速完成從基因組DNA去除到cDNA合成的全過(guò)程。
使用本制品合成的cDNA適用于嵌合法和探針?lè)╭PCR分析，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇與TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820Q/A/B)*、TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR420A/B)*、Probe qPCR Mix (Code No. RR391S/A/B) 組合使用。 |
*：Takara嵌合法Real Time PCR（qPCR）產(chǎn)品的名稱從2017年12月下旬開(kāi)始，將逐步變更為「TB Green系列」。產(chǎn)品Code、性能和原有產(chǎn)品相比沒(méi)有變化，請(qǐng)繼續(xù)放心使用。
產(chǎn)品名稱將隨新lot的產(chǎn)品逐步變更，產(chǎn)品網(wǎng)頁(yè)或操作說(shuō)明書(shū)可能會(huì)先于產(chǎn)品標(biāo)簽變更，望知悉！ |
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| ■ 保存 |
-20℃。
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| ■ 試劑盒特長(zhǎng) |
1. 含有去除基因組DNA的gDNA Eraser，只需2 min即可除去基因組DNA。
2. 只需15 min即可高效合成Real Time PCR反應(yīng)用模板cDNA，是進(jìn)行2 Step Real Time RT-PCR反應(yīng)的理想試劑。
3. 反轉(zhuǎn)錄引物使用了Random 6 mers和Oligo dT Primer混合的RT Primer Mix，可以均勻合成樣品中的各種cDNA。
4. 本制品提供了TB Green qPCR分析法和探針qPCR分析法各自適合的反應(yīng)體系，可以根據(jù)分析方法選擇體系。
TB Green qPCR分析法和探針qPCR分析法區(qū)別如下：
(1) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中RT Primer Mix的用量。
(2) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中總RNA的用量。
5. Real Time RT PCR定量需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件就是需要將總RNA和反轉(zhuǎn)錄cDNA稀釋到較低的濃度。如果用水或TE Buffer稀釋時(shí)，由于模板濃度低不穩(wěn)定，因而會(huì)縮小曲線范圍，結(jié)果準(zhǔn)確度降低。本制品中附加了標(biāo)準(zhǔn)曲線制作用稀釋液EASY Dilution (for Real Time PCR) ，將Total RNA或cDNA稀釋至低濃度時(shí)也能夠進(jìn)行準(zhǔn)確稀釋，容易在寬廣范圍內(nèi)獲得準(zhǔn)確定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
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| ■ 注意事項(xiàng) |
1．使用本制品合成的cDNA與TB Green關(guān)聯(lián)制品組合使用時(shí)，建議使用：
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Code No.RR820Q/A/B)
TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR420Q/A/B)
以上制品與本制品組合使用，可以得到可信度高的結(jié)果。
本制品與TB Green Fast qPCR Mix (Code No. RR430S/A/B) 組合使用時(shí)，有時(shí)反應(yīng)性能不好，不推薦使用。
2. 當(dāng)同時(shí)需要進(jìn)行數(shù)次反應(yīng)時(shí)，應(yīng)先配制各種試劑的混合液 (Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、酶等)，然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中。這樣可使所取的試劑體積更準(zhǔn)確，減少試劑損失，避免重復(fù)分取同一試劑。同時(shí)也可以減少實(shí)驗(yàn)操作或?qū)嶒?yàn)之間產(chǎn)生的誤差。
3. gDNA Eraser和PrimeScript RT Enzyme Mix I 在使用前要小心地離心收集到反應(yīng)管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取時(shí)應(yīng)慢慢吸取。同時(shí)，要使用精確、量程適合的移液槍，并且不要使Tip插入液面過(guò)深，否則會(huì)因Tip壁粘著造成損失，而使酶量不足。
4. 5X gDNA Eraser Buffer和5X PrimeScript Buffer 2（for Real Time）在使用前需Vortex振蕩混勻，輕輕離心后使用。
5. 分裝試劑時(shí)務(wù)必使用新的槍頭 (Tip)，以防止樣品間污染。
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京公網(wǎng)安備 110114000405號(hào)
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