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『石以砥焉，化鈍為利！』Takara匠心打磨FFPE樣本分析利器

工欲善其事必先利其器，分析FFPE樣本必須選對技術(shù)與試劑。本專題將向您介紹Takara科學(xué)家匠心打磨出的FFPE樣本分析利器，幫您填平FFPE樣本核酸擴(kuò)增難、定量難、NGS建庫難、結(jié)果一致性不足這幾個大坑，使分析FFPE樣本變得都挺好。

福爾馬林固定石蠟包埋（Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded, FFPE）技術(shù)是一種先用福爾馬林固定，再用石蠟包埋臨床組織樣本的處理方法。由其可長期常溫保存的特點被全球的醫(yī)院或組織樣本庫大量采用，供組織學(xué)診斷及研究使用。
隨著qPCR、NGS等技術(shù)發(fā)展，數(shù)億份FFPE樣本有了更大的研究價值。這些珍貴并來源廣泛的醫(yī)學(xué)研究材料為回顧性研究、闡明疾病發(fā)病機(jī)理、Biomarker篩查、預(yù)后指示等提供了寶貴的資源。
然而，福爾馬林固定樣本時，組織中的核酸容易發(fā)生不同程度的降解與分子間交聯(lián)，石蠟的高溫滲入又進(jìn)一步加速核酸的降解，保存時間及環(huán)境對核酸也有不小影響，即FFPE樣本中不易留存高品質(zhì)核酸。同時，提取核酸前不當(dāng)?shù)那疤幚矸桨福缓线m的擴(kuò)增方法與條件也不易獲得足夠量的核酸。再者，若一次性分析的樣本量較大，實驗員的樣本處理、儀器和方法之間的微小差異會引起結(jié)果發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致核酸質(zhì)量、下游實驗結(jié)果的可靠性、重復(fù)性與一致性存疑。
以上因素，讓科研工作者既要面對挑戰(zhàn)與困難，又不忍舍棄FFPE樣本這一“寶藏”，to do or not to do, that’s a question?

有了Takara FFPE樣本分析利器，事情正在發(fā)生變化！

突破瓶頸，DV200=25%的FFPE樣本進(jìn)行RNA-Seq研究成為可能！

從FFPE樣本中分離純化核酸進(jìn)行NGS分析研究逐漸成為重要手段，但由于FFPE樣本容易發(fā)生核酸的降解和損傷，所以從有限且珍貴的FFPE樣本中獲得完整且準(zhǔn)確的信息進(jìn)行建庫測序無疑是“難于上青天”！Takara傾力打造的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian，具有難以置信的RNA品質(zhì)包容度，可以5-50 ng FFPE來源的total RNA起始，即使是品質(zhì)較差的樣本，也可以構(gòu)建高品質(zhì)的文庫！同時采用全新的Zap R v2 R-Probes v2核糖體cDNA去除技術(shù)，不需要進(jìn)行rRNA去除的前處理操作，不要太好用！

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一個神奇的FFPE樣本建庫神器之RNA篇

快人一步，僅需2h即可完成FFPE樣本的DNA-Seq文庫構(gòu)建！

FFPE樣本，作為生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要樣本來源，廣受研究者的青睞。但由于多種因素影響，一般從FFPE樣本中難以獲得高質(zhì)量且足量的DNA。因此在構(gòu)建文庫時，文庫的轉(zhuǎn)化效率差，文庫片段較小，測序重復(fù)序列較多，覆蓋度較低等一系列問題頗受詬?。?strong>ThruPLEX DNA-Seq Kit使用特別的莖環(huán)型接頭，整個建庫過程無需轉(zhuǎn)管和純化，可以100 ng FFPE來源的DNA起始2小時內(nèi)完成構(gòu)建文庫，從而實現(xiàn)對FFPE樣本進(jìn)行有效分析！

（以上比較數(shù)據(jù)來源于Takara Bio USA ,Inc.）

應(yīng)用文獻(xiàn)

1. B. Lawrence ., Recurrent loss of heterozygosity correlates with clinical outcome in pancreatic neuroendocrine cancer. npj Genomic Medicine (2018)

2. S-F Chin et al., Shallow whole genome sequencing for robust copy number profiling of formalin- fixed paraffin-embedded breast cancers. bioRxiv Prepr. (2017).

3. P. Cejas et al., Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumorspecific enhancer profiles. Nat. Med. 22, 685–691 (2016).

FFPE樣本難擴(kuò)增？改良的MightyAmp^™ Ver.3發(fā)揮威力！

數(shù)量巨大的FFPE樣本蘊(yùn)含著無限的科學(xué)研究機(jī)會，但同時也是研究者們很棘手的研究對象，如何從樣本中獲得生物信息就顯得至關(guān)重要。PCR技術(shù)作為分子檢測領(lǐng)域中較為普遍的技術(shù)，大大提高了FFPE組織樣本的臨床應(yīng)用。
Takara作為PCR酶的重要企業(yè)，自1994年開始銷售PCR酶以來，為了滿足科研人員的各種要求，一直致力于新產(chǎn)品的開發(fā)。特別研發(fā)的MightyAmp^™ 系列具有很強(qiáng)的擴(kuò)增性能，對于使用普通PCR酶難以擴(kuò)增的樣本，也顯示出很好的擴(kuò)增能力，如含有大量PCR阻害物的生體粗提樣本。
MightyAmp DNA Polymerase Ver.3是對MightyAmp DNA Polymerase進(jìn)行了改良，這種改良后的PCR酶和Buffer組合使用，可進(jìn)一步增強(qiáng)對PCR阻害物的抵抗性。此外，也提高了血液、動植物組織等生物體樣本直接加入到反應(yīng)液中的Direct PCR的反應(yīng)性能。無論是PCR阻害物含量較多的粗提樣本，還是GC Rich、AT Rich的模板均可在寬廣的模板范圍內(nèi)進(jìn)行有效擴(kuò)增，并根據(jù)需要將試劑盒中附帶的10×Additive for High Specificity添加到PCR反應(yīng)液中可提高PCR擴(kuò)增的特異性和檢測靈敏度。

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MightyAmp^™ DNA Polymerase Ver.3

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一步法cDNA合成反應(yīng)，操作簡單。Takara RT-qPCR方案高靈敏度定量FFPE來源miRNA！

癌癥已經(jīng)成為人類的“殺手”，較難醫(yī)治。國際抗癌聯(lián)盟認(rèn)為，1/3的癌癥是可以預(yù)防的，1/3的癌癥如能早期診斷是可以治愈的，1/3的癌癥可以減輕痛苦，延長生命。FFPE樣本作為生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要樣本來源，已經(jīng)成為許多研究人員重要的癌癥研究材料。
當(dāng)前，研究人員更迫切需要一種快速有效的癌癥研究方法。RT-qPCR就是一種可以快速，靈敏地定量基因表達(dá)的技術(shù)，能從相對少量的起始材料（如FFPE樣本）中檢測mRNA，miRNA，lncRNA的差異表達(dá)。該技術(shù)應(yīng)用廣泛，檢測靈敏度高，檢測低拷貝RNA非常實用。
這其中需要特別說明microRNA的定量研究。microRNA是一類被廣泛關(guān)注的非編碼RNA，對植物和動物的基因表達(dá)有著非常重要的調(diào)控作用。長度為22 nt左右，與普通的捕獲探針或PCR引物的長度相當(dāng)，并且GC% 含量從5%-95%，差異較大，普通檢測方法很難獲得足夠的靈敏度，所以需要針對microRNA優(yōu)化qPCR體系。
Takara提供用于microRNA定量檢測的Mir-X^™ 系列產(chǎn)品。Mir-X^™ 系列為簡單的一步法cDNA合成系統(tǒng)、一次反轉(zhuǎn)FFPE樣本中的不同microRNA。試劑盒附帶通用的PCR下游引物，只需設(shè)計特異性的上游引物即可?？蓪Φ椭?0 copies的microRNA進(jìn)行檢測，靈敏度高。高度特異性檢測不同的miRNA變種。

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Mir-X^™ miRNA qRT-PCR TB Green^™ Kit

應(yīng)用文獻(xiàn)

1. Makino, K. et al. Inhibition of uterine sarcoma cell growth through suppression of endogenous tyrosine kinase B signaling. PLoS One 7, e41049 (2012).

2. Jiang, Y. et al. Aberrant expression of RSK4 in breast cancer and its role in the regulation of tumorigenicity. Int. J. Mol. Med. 40, 883–890 (2017).

3. Taek Sang Lee et al. Aberrant MicroRNA Expression in Endometrial Carcinoma Using Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) Tissues. PLoS One. 2013; 8(12): e81421.

一次最多運行5184個qPCR反應(yīng)的Real-Time PCR系統(tǒng)，高通量檢測FFPE來源miRNA！

數(shù)以億份的FFPE樣本保存著巨大的科學(xué)研究價值。除核酸提取、建庫等難題外，如何高效、快速、準(zhǔn)確地完成大量樣本的分析檢測工作，也同樣是需要面對的挑戰(zhàn)。
SmartChip Real-Time PCR System是高通量qPCR系統(tǒng)。一次運行可同時進(jìn)行最多5,184個qPCR反應(yīng)。靈活的Assay × Sample組合，可添加或刪除各個PCR反應(yīng)。2小時即可完成qPCR反應(yīng)和數(shù)據(jù)分析。100 nL反應(yīng)體系，既保證檢測的靈敏度，又節(jié)約了試劑成本。

SmartChip Real-Time PCR系統(tǒng)憑借高通量、靈活性強(qiáng)的特性幫助許多研究人員對各類型樣本中的核酸進(jìn)行檢測分析。
來自盧森堡聯(lián)合生物樣本庫（Integrated Biobank of Luxembourg, IBBL）的研究人員，對不同固定處理時間的不同組織FFPE樣本中miRNA和snoRNA（small nucleolar RNA，核仁小RNA）進(jìn)行了分析研究。MicroRNAs（miRNAs）因其結(jié)構(gòu)短小，即使在FFPE樣本中依然有很好的穩(wěn)定性。當(dāng)前研究表明，miRNAs可以作為生物標(biāo)志物用于疾病診斷，如癌癥相關(guān)研究。憑借SmartChip系統(tǒng)高通量、高重復(fù)性的表現(xiàn)，配合我們的SmartChip Human miRNA Panel v3.0，研究人員完成了對超過1,000個miRNA和snoRNA的分析工作，并進(jìn)一步開發(fā)出了“snoRNA score”評價系統(tǒng)，一次運行即可對40種樣本進(jìn)行評價檢測，該評價系統(tǒng)可以幫助更多研究人員對FFPE樣本進(jìn)行評價分析。

工作流程：

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，F(xiàn)FPE樣本制作保存水平也會不斷提高，研究人員可以對FFPE樣本中更多類型的核酸進(jìn)行檢測分析。選擇SmartChip Real-Time PCR System，快速、靈活、高效完成FFPE樣品核酸檢測分析，F(xiàn)FPE樣品再多也不愁！