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雙鏈cDNA合成試劑盒PrimeScript^™ Double Strand cDNA Synthesis Kit
品牌	Code No.	產(chǎn)品名稱	包裝量	價(jià)格（元）	說(shuō)明書	數(shù)量
Takara	6111A	PrimeScript^™ Double Strand cDNA Synthesis Kit	10 Rxns	￥1,629

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■ 制品內(nèi)容 (10 次量)

PrimeScript RTase (200 U/μl)	10 μl
RNase Inhibitor (40 U/μl)	10 μl
Oligo(dT)18 Primer (1 μg/μl)	20 μl
Random Primer (9mer) (0.3 μg/μl)	20 μl
5 × 1st Strand Synthesis Buffer	40 μl
dNTP Mixture (10 mM each)	40 μl
E. coli RNase H/E. coli DNA Ligase Mixture	20 μl
E. coli DNA Polymerase I (20 U/μl)	20 μl
5 × 2nd Strand Synthesis Buffer	300 μl
T4 DNA Polymerase (1 U/μl)	40 μl
RNase free dH2O	600 μl × 2
Control RNA (1 μg/μl)^*	5 μl

*【Control RNA】本試劑盒中的Control RNA是以pSPTet3質(zhì)粒 (質(zhì)粒中的SP6啟動(dòng)子下游插入長(zhǎng)約1.4 kb的pBR322來(lái)源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四環(huán)素基因) 為模板由SP6 RNA聚合酶經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄而得到的。Control RNA (約1.4 kb) 是帶有30個(gè)A堿基的具有poly (A)⁺尾的RNA。以這種RNA為模板合成的雙鏈cDNA插入到適當(dāng)?shù)馁\|(zhì)粒載體中，如果確實(shí)為全長(zhǎng)的cDNA，那這種質(zhì)粒便可獲得四環(huán)素抗性。

■ 制品說(shuō)明

以原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞的mRNA為模板合成cDNA后再進(jìn)行cDNA的克隆，是分子生物學(xué)研究中的一種重要手段。利用這一技術(shù)可以容易地進(jìn)行基因的構(gòu)造解析和目的蛋白質(zhì)的表達(dá)研究等。
一般來(lái)說(shuō)，cDNA的合成以及cDNA文庫(kù)的利用方法是：在合成與目的mRNA互補(bǔ)的雙鏈cDNA后，將雙鏈cDNA與細(xì)菌或病毒來(lái)源的載體進(jìn)行重組，再將重組體導(dǎo)入細(xì)菌或真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增cDNA，然后再對(duì)cDNA進(jìn)行解析，或者再進(jìn)一步進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄或體外翻譯等。
本試劑盒主要以來(lái)自植物和動(dòng)物的poly (A)⁺RNA合成雙鏈DNA 。
本試劑盒主要是以Gubler-Hoffman法為基礎(chǔ)構(gòu)建的，其原理見(jiàn)圖1、圖2，簡(jiǎn)要說(shuō)明如下：
1. 在PrimeScript RTase的作用下，利用Oligo(dT)18 Primer或者Random Primer合成cDNA的第一條鏈。
2. 使用E. coli RNase H使DNA-RNA雜合體中的RNA鏈形成單鏈切口 (Nick) 。在E. coli DNA Polymerase I 與E. coli DNA Ligase的作用下，RNA鏈被DNA鏈置換，合成cDNA的第二條鏈。
3. 使用T4 DNA Polymerase使雙鏈cDNA片段末端平滑。

■ cDNA合成原理圖

圖1 使用Oligo(dT)18 Primer時(shí)的cDNA合成

圖2 使用Random Primer時(shí)的cDNA合成

■ 保存

-20℃。

■ Troubleshooting

如果實(shí)驗(yàn)不能正常進(jìn)行，請(qǐng)按照說(shuō)明書內(nèi)容確認(rèn)實(shí)驗(yàn)操作，檢驗(yàn)以下幾點(diǎn)：
1. Control RNA的使用
本試劑盒中的Control RNA (pSP Tet3 Poly(A)⁺ mRNA) 可以用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)，并確認(rèn)1st Strand cDNA或2nd Strand cDNA的合成反應(yīng)是否順利進(jìn)行。
2. mRNA的純度檢測(cè)
為了能夠獲得更高的cDNA合成效率，盡可能使用完整的mRNA是非常重要的。在進(jìn)行cDNA合成反應(yīng)前，可以通過(guò)測(cè)定260 nm和280 nm的吸光度 (A260/A280在1.8～2.1是理想值) ，或使用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)RNA的純度進(jìn)行檢測(cè)。
3. RNase的污染
實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意一定不能在mRNA的樣品中混入RNase。實(shí)驗(yàn)用的器具、試劑等應(yīng)盡可能進(jìn)行高溫滅菌處理。操作過(guò)程要佩戴手套。

頁(yè)面更新：2023-12-01 16:12:01

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