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產(chǎn)品選擇指南

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3’-RACE試劑盒3’-Full RACE Core Set with PrimeScript™ RTase
品牌 Code No. 產(chǎn)品名稱 包裝量 價(jià)格（元） 說(shuō)明書(shū) 數(shù)量
Takara 6106 3'-Full RACE Core Set with PrimeScript™ RTase 20 Rxns ￥1,950
 
■ 制品內(nèi)容 (20 次量)
制品內(nèi)容1～9項(xiàng)為用于3’RACE實(shí)驗(yàn)的反轉(zhuǎn)錄用試劑，可用于20次反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) (約100次3’RACE PCR反應(yīng))；10～12為Control實(shí)驗(yàn)用試劑，可進(jìn)行5次Control實(shí)驗(yàn)。
1. PrimeScript RTase (200 U/μl) 10 μl
2. RNase Inhibitor(40 U/μl) 10 μl
3. 5 × PrimeScript Buffer 40 μl
4. dNTP Mixture (10 mM each) 20 μl
5. 3’RACE Adaptor (5 μM) 20 μl
6. RNase Free dH2O 1 ml
7. 1 × cDNA Dilution Buffer II 1 ml
8. 3’RACE Outer Primer (10 μM ) 200 μl
9. 3’RACE Inner Primer (10 μM ) 200 μl
10. Control HL60 Total RNA (500 ng/μl)* 10 μl
11. 3’RACE Control Outer Primer (10 μM)* 10 μl
12. 3’RACE Control Inner Primer (10 μM)* 10 μl
   
* 用于擴(kuò)增Human Prohibitin (PHB) 基因。
 
■ 制品說(shuō)明
本試劑盒是高靈敏度、高特異性擴(kuò)增cDNA 3’末端全長(zhǎng)的試劑盒。對(duì)RNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析時(shí)，一般先通過(guò)RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的區(qū)域，然后再對(duì)擴(kuò)增出的目的DNA片段進(jìn)行克隆、序列分析等。一般的RT-PCR反應(yīng)很難得到全長(zhǎng)的cDNA片段，然而在基因工程研究中，分析遺傳基因的全長(zhǎng)cDNA序列又是十分重要的。RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 法能有效地解決這一問(wèn)題。3’-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase能夠通過(guò)已知的cDNA序列，高靈敏度、高特異性地?cái)U(kuò)增cDNA的3’末端的全長(zhǎng)序列。
本試劑盒中含有完成3’-RACE操作的主要試劑。試劑盒中使用的PrimeScript Reverse Transcriptase經(jīng)過(guò)了本公司的特殊改良，反轉(zhuǎn)錄性能良好，無(wú)RNase H活性，大大增加了反轉(zhuǎn)錄性能。結(jié)合使用TaKaRa LA Taq (Code No.: RR002A) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其3’RACE的擴(kuò)增性能大大優(yōu)于其他同類產(chǎn)品。 本試劑盒應(yīng)用了套式PCR原理，增加了PCR擴(kuò)增的特異性與靈敏度，可以對(duì)少量樣品或低豐度的基因進(jìn)行3’RACE實(shí)驗(yàn)，并且對(duì)長(zhǎng)片段的3’RACE擴(kuò)增具有明顯優(yōu)勢(shì)，我們?cè)?jīng)使用本試劑盒成功擴(kuò)增了8 kb的3’RACE DNA片段。使用TaKaRa LA Taq™ 擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物3’端附有一個(gè)“A” 堿基，其產(chǎn)物可直接克隆于T-Vector中。反轉(zhuǎn)錄引物3’RACE Adaptor Primer含有由Takara特別設(shè)計(jì)的dT區(qū)域，反轉(zhuǎn)錄效率高。3’RACE Inner Primer中含有BamH I酶切位點(diǎn)，為克隆實(shí)驗(yàn)提供了方便。制品中的Control RNA及Control Primer可以用于Control實(shí)驗(yàn)。
 
■ 各種引物的序列
引物名稱 引物序列 (5’→3’)
   3’RACE Adaptor    含有由Takara特別設(shè)計(jì)的dT區(qū)域及Adaptor Primer部分
   3’RACE Outer Primer    TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT
   3’RACE Inner Primer    CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG
   3’RACE Control Outer Primer    GAGTGCAGGACATTGTGGTAGGG
   3’RACE Control Inner Primer    ATCTTTGACTGCCGTTCTCGACC
 
 
■ 試劑盒原理
進(jìn)行3’RACE 實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先由PrimeScript Reverse Transcriptase將Poly(A)+RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再使用TaKaRa LA Taq (Code No.: RR002A)，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行套式PCR反應(yīng)。3’RACE Adaptor Primer作為反轉(zhuǎn)錄引物用于cDNA合成 (具體原理見(jiàn)圖1)。
 
圖1. 3’-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase的實(shí)驗(yàn)原理圖
 
1. 以Total RNA為模板，使用3’RACE Adaptor引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成1st Strand cDNA。
2. 使用上游外側(cè)特異性引物 (GSP1) 和3’RACE Outer Primer進(jìn)行1st PCR反應(yīng)。如果1st PCR反應(yīng)未能得到目的產(chǎn)物，再使用上游內(nèi)側(cè)特異性引物 (GSP2) 和3’RACE Inner Primer進(jìn)行2nd PCR反應(yīng)。
3. PCR產(chǎn)物可以直接進(jìn)行DNA測(cè)序或TA克隆。如果使用含有BamH I酶切位點(diǎn)的上游內(nèi)側(cè)特異性引物進(jìn)行2nd PCR擴(kuò)增時(shí)，可以使用限制酶 (BamH I) 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，然后克隆至相關(guān)的載體中。
 
■ 注意事項(xiàng)
1. 同時(shí)需要進(jìn)行數(shù)次反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或PCR反應(yīng)時(shí)，應(yīng)先配制各種試劑的混合液 (Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture等)，然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中。這樣，可使所取的試劑體積更準(zhǔn)確，減少試劑損失，避免重復(fù)分取同一試劑。同時(shí)也可以減少實(shí)驗(yàn)操作或?qū)嶒?yàn)之間產(chǎn)生的誤差。
2. 使用PrimeScript Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor等酶類時(shí)，應(yīng)輕輕混勻，避免起泡，分取之前要小心地離心收集到反應(yīng)管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取時(shí)應(yīng)慢慢吸取。
3. 酶制品應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前才從-20℃中取出，使用后也應(yīng)立即放回-20℃中保存。
4. 為了防止Control RNA分解，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。有條件的實(shí)驗(yàn)室建議保存于-70℃至-80℃。
5. 分裝試劑時(shí)務(wù)必使用新的槍頭 (Tip)，以防止樣品間污染。
 
 

頁(yè)面更新：2024-01-25 15:06:08

關(guān)聯(lián)信息

參考文獻(xiàn)

3’-Full RACE Core Set with PrimeScript™ RTase的使用文獻(xiàn)

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