| PrimeCap T7 RNA Polymerase（low dsRNA）是改良的T7 RNA聚合酶*，兼具Cap類似物依賴性RNA合成、低dsRNA生成和耐熱性（～52℃）的特點。使用了本酶和Cap類似物的體外轉(zhuǎn)錄 （IVT），可大量制備具有高加帽效率的高質(zhì)量mRNA，同時大幅減少具有免疫原性dsRNA的生成。因此，本制品適用于疫苗等RNA醫(yī)藥領(lǐng)域的研發(fā)。 |
| *以T7啟動子序列為模板，NTP為底物的雙鏈DNA，通過轉(zhuǎn)錄啟動子下游區(qū)域，在體外合成單鏈RNA的酶。 |
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典型的T7啟動子序列和轉(zhuǎn)錄起始點（使用 CleanCap Reagent AG（TriLink公司）時的注意事項）
用于制備IVT反應(yīng)的模板DNA的典型T7啟動子序列如下所示。需要根據(jù)要合成的RNA序列和用于5'-cap修飾的Cap類似物的特性來設(shè)計模板，因此，請根據(jù)實驗?zāi)康臏?zhǔn)備模板DNA。
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[使用CleanCap Reagent AG時]
建議轉(zhuǎn)錄起點（+1 位置）的 NGG 序列為 AGG
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[合成未加帽的RNA時]
建議轉(zhuǎn)錄起點（+1 位置）的 NGG 序列為 AGG或GGG
[使用ARCA時]
建議轉(zhuǎn)錄起點 （+1位置）的 NGG 序列為 GGG
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| 圖1. FLuc mRNA合成產(chǎn)量（約1.9 kb）（左圖）、抑制dsRNA產(chǎn)生效果（中圖）和dsRNA含量（右圖） |
| 以Takara IVTpro T7 mRNA合成試劑盒（Code No. 6144）的組分中的陽性對照（FLuc）作為模板，分別使用T7 RNA Polymerase ver.2.0（Code No. 2541A）和PrimeCap™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA)（Code No. 2560A）來合成mRNA，體系為20 μl 反應(yīng)，參考使用例。比較37℃下的IVT反應(yīng)結(jié)果時，使用2560A合成mRNA時產(chǎn)生的副產(chǎn)物dsRNA，與2541A相比可以降低到10%甚至更低，且不會影響mRNA的合成產(chǎn)量。 |
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| 圖2. 不同Cap類似物濃度的mRNA產(chǎn)量（左上）、加帽效率（右上）和蛋白質(zhì)表達水平（左下）的比較 |
| 以Positive Control Template (FLuc)為模板，使用PrimeCap™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA)（Code No. 2560A）或T7 RNA Polymerase ver.2.0（Code No. 2541A）與不同濃度（0、2、4、6、8 mM）的CleanCap Reagent AG（TriLink）進行IVT反應(yīng)合成FLuc mRNA（約1.9 kb），并測定mRNA產(chǎn)量（左上圖）。通過LC/MS測定合成的mRNA的加帽效率（右上圖）。 此外，將合成的FLuc mRNA轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中，通過FLuc法評估細胞中的蛋白質(zhì)表達水平（左下圖）。mRNA的產(chǎn)量隨著CleanCap Reagent AG的濃度而增加（左上圖），即使使用低濃度的CleanCap Reagent AG，也顯示了其高加帽效率（右上圖）。此外，用該產(chǎn)品合成的mRNA在所有CleanCap Reagent AG濃度下都具有高蛋白質(zhì)表達水平（左下圖）。 |
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| ■ 保存 |
| －20℃ |
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| ■ 起源 |
| Escherichia coli carrying a plasmid containing the gene for phage T7 RNA polymerase variant. |
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| ■ 性質(zhì) |
1. 分子量：約99.8 kDa
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輔因子：Mg2+ |
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| ■ 活性定義 |
| 在 37℃，1 小時內(nèi)使 1 nmol [3H] GMP 摻入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定義為1個活性單位（U)。 |
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| ■ 用途 |
1. 使用Cap類似物合成帶帽的mRNA（共轉(zhuǎn)錄加帽）
2. 用于酶法加帽的無帽RNA的合成
※ 與使用Cap類似物時相比，RNA產(chǎn)量減少10%～40%。
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| ■ 使用注意 |
1. 酶不要劇烈攪拌。
2. 當(dāng)dsDNA模板、試劑、試管或微量移液器吸頭被RNase污染時，合成的RNA產(chǎn)量會降低或者出現(xiàn)片段化。在實驗過程中應(yīng)采取預(yù)防措施以避免RNase污染，例如戴一次性手套和使用專門用于 RNA實驗的試管和微量移液器吸頭。
3. 為了合成長度一致的RNA，通常使用線性dsDNA（例如線性化質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物）用于體外轉(zhuǎn)錄。我們建議模板DNA末端應(yīng)為5’-突出或平端，以避免出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物?？筛鶕?jù)具體情況，使用BspQ I等限制酶使模板DNA線性化。
4. 緩沖液中的亞精胺會與核酸形成復(fù)合物并可能產(chǎn)生沉淀，因此模板DNA應(yīng)在加酶之前即倒數(shù)第二步再加入反應(yīng)體系中。
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