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產(chǎn)品選擇指南

技術(shù)服務(wù)信息

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限制酶使用說明
一、分類
目前，已被發(fā)現(xiàn)的限制酶，根據(jù)其反應(yīng)的必須因子和切斷點等特性，被分為以下三大類：
類 別 反應(yīng)必須因子 切 點 酶 例
   I 型  s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg2+  識別部位和切點不同，切斷部位不定   EcoB、EcoK
   II 型     Mg2+  切斷識別部位或其附近的特定部位   EcoR I、BamH I
   III 型     ATP、Mg2+  識別部位和切點不同，但切斷特定部位   EcoP I、Hinf III
應(yīng)用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II型酶，現(xiàn)在市場上銷售的酶都屬于II型酶, 這些限制酶由于其反應(yīng)條件和底物DNA種類的不同，其切斷狀況及出現(xiàn)Star活性的頻率等各有不同，并且其程度也根據(jù)酶的不同而千差萬別。因而在使用限制酶時，必須對這些要素充分注意，確保目標(biāo)序列的切斷反應(yīng)能順利進行，下面具體介紹一下使用限制酶時的一些注意點。
 
二、注意事項
1. 甲基化的影響
    從帶有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制備的DNA，其堿基的一部分已經(jīng)被甲基化，因此即便使用能夠識別、切斷被甲基化部分的序列的限制酶，也不能很好地切斷被甲基化的部分。被甲基化的部位，根據(jù)底物DNA及宿主種類的不同而不同。例如宿主菌為大腸桿菌的情況下，根據(jù)宿主的種類有以下兩種情況：
                
    在進行轉(zhuǎn)化時，通常使用的菌株為C600、HB101、JM109等，因為都帶有dam、dcm甲基化酶，所以使用這些菌株制備的DNA時，必須注意。另外，動物由來的DNA，CG序列多為5mCG；植物由來的DNA，CG及CNG序列多為5mCG和5mCNG。
2. Star活性
    限制酶在一些特定條件下使用時，對于底物DNA的特異性可能降低。即可以把與原來識別的特定的DNA序列不同的堿基序列切斷，這個現(xiàn)象叫Star活性。Star活性出現(xiàn)的頻率，根據(jù)酶、底物DNA、反應(yīng)條件的不同而不同，可以說幾乎所有的限制酶都具有Star活性。并且，它們除了識別序列的范圍增大之外，還發(fā)現(xiàn)了在DNA的一條鏈上加入切口的單鏈切口活性，所以為了抑制Star活性，一般情況下，即使會降低反應(yīng)性能，我們也提倡在低甘油濃度、中性pH、高鹽濃度條件下進行反應(yīng)。
3. 部分分解
    如果使用預(yù)計的限制酶對底物DNA進行作用，而未能完全將其切斷，其原因除了上述兩點和酶失活之外，DNA的純度、反應(yīng)阻害物的影響、DNA的種類等也有關(guān)系。特別是由于DNA種類不同，它們的大小、切點數(shù)也不同，達到完全分解時，所需要的酶量也不同，從這些數(shù)據(jù)中計算出的 [完全分解1 μg DNA所需要的限制酶預(yù)計量] 與 [實際量]，也因限制酶的種類不同而有差別，這些差別被認為是酶同其識別位點周圍的高級結(jié)構(gòu)親和程度而產(chǎn)生的。例如， 限制酶Nae I 在切斷pBR322 DNA時，就有著非常難以切斷的部位。另外，因反應(yīng)液組成變化 (如添加精脒)，也可以使切斷順序發(fā)生變化。
4. DNA結(jié)合物質(zhì)
    限制酶切反應(yīng)后進行電泳時, 有時會發(fā)生電泳帶無法確認、電泳帶擴散、電泳帶移動距離異常等問題，這是由于酶蛋白自身或其它雜蛋白與DNA結(jié)合在一起，使DNA沒有進入電泳凝膠中，或DNA難以被溴乙錠染色而造成的。發(fā)生這些現(xiàn)象時，在試樣中加入一些蛋白質(zhì)變性劑 (如SDS，終濃度0.1%左右)，便可改善電泳效果。
5. 其它
    限制酶的保質(zhì)期一般是在檢定日以后的18～24個月內(nèi)，但大多數(shù)的限制酶在超過保質(zhì)期后都不會急劇失活, 因此購入后即使是經(jīng)過長時間保存的酶，也完全可以使用。
 
三、活性定義
    限制酶的一個活性單位 (1 U)，原則上是在50 μl 的反應(yīng)液中，37℃的溫度條件下，經(jīng)過1小時反應(yīng)，將1 μg DNA完全分解所需要的酶量。關(guān)于測定活性用的底物DNA以及溫度，在后面的資料中對每種酶都做了詳細介紹。此外酶在其它通用緩沖液中的相對活性，在附表中也有總括記載。
 
四、純度檢定
    每個批號的酶基本上都要進行下列項目的檢測：
1. 過剩量酶反應(yīng)檢定
    在1 μg底物DNA (通常用λDNA) 中加入過量的限制酶，反應(yīng)15～18小時，然后進行瓊脂糖電泳，根據(jù)電泳圖譜，判斷酶中是否夾雜有非特異性核酸酶。
2. 基因組DNA分析
    對指定的限制酶 (在酶的分項介紹中標(biāo)明) 進行該項檢測。在適當(dāng)?shù)募毦鶧NA底物中 (瓊脂糖凝膠塊中的DNA濃度為0.5 μg/50 μl) 加入20～150 U的限制酶，反應(yīng)24小時，然后進行瓊脂糖電泳，根據(jù)電泳圖譜，確認酶中是否含有雜質(zhì)。
3. 連接—再切檢定
    把底物DNA首先與2～50倍過量的酶反應(yīng)， 然后回收切斷后的DNA，把它溶解于T4 DNA連接酶的緩沖液中 [66 mM Tris-HCI (pH7.6)，6.6 mM MgCl2，10 mM DTT，0.4 mM ATP] 使其5’末端濃度成為0.1～1.0 μM，加入適量的T4 DNA連接酶， 在16℃下反應(yīng)1小時或16～18小時，再回收DNA后，把它溶解于限制酶反應(yīng)液中，用同樣的限制酶再進行切斷反應(yīng)。通過以上的實驗結(jié)果，可以判斷是否存在連接酶抑制劑或磷酸酶以及核酸外切酶等雜質(zhì)。
4. pKF3克隆檢測
    對于在強制克隆載體pKF3 DNA的多克隆位點上有一個切斷點的限制酶，可以進行該項檢測。用10倍過量的被檢測的限制酶對pKF3 DNA進行作用，失活處理后，將已切斷的DNA用DNA連接試劑盒在16℃、30 min的條件下進行反應(yīng)，將該反應(yīng)液的一部分轉(zhuǎn)化到TH2感受態(tài)細胞中，用兩種培養(yǎng)基 (LB-Cm-Sm、LB-Cm) 在37℃的條件下培養(yǎng)兩個晚上，根據(jù)LB-Cm-Sm培養(yǎng)基上是否出現(xiàn)菌落，來判斷限制酶中是否含有微量的核酸外切酶。
 
五、甲基化的影響
    如果限制酶識別序列中的堿基被甲基化，則根據(jù)被甲基化堿基的種類及位置的不同，有時會發(fā)生該DNA切不開的現(xiàn)象。

    大多數(shù)大腸桿菌都帶有2種具有特異性識別位點的甲基化酶，即dam methylase (G6mATC) 和dcm methylase (C5mCWGG)， 因此，從這些大腸桿菌中提取的DNA，該序列一般被甲基化。
    另外，哺乳類由來的DNA，大多受CG methylase (5mCG) 的影響而被甲基化。

    受dam methylase、dcm methylase、CG methylase影響的限制酶，在酶的單項介紹中都做了提示，希望在使用中加以注意。
 
六、Star活性
    限制酶根據(jù)反應(yīng)條件的不同，可能會切斷與原來識別序列不同的位點， 這種不同于原有的特異性的活性，稱為Star活性，在各種酶的分項介紹中，我們將容易產(chǎn)生Star活性的酶，以及產(chǎn)生的條件做了注明。
 
七、雙酶切反應(yīng)

    使用兩種酶同時進行DNA切斷反應(yīng) (Double Digestion)，是實驗操作中常用的手段之一。此時，使用Buffer非常重要。在"Double Digestion(雙酶切反應(yīng))時Universal Buffer(通用緩沖液)的使用表 "中，介紹了TaKaRa經(jīng)長年研討的雙酶切反應(yīng)的Buffer系統(tǒng)，供實驗參考之用。
 
八、限制酶末端的相互連接

    盡管限制酶不同，但只要酶切后產(chǎn)生的切口序列相互吻合，就可以進行相互連接。
 
九、保存溫度
    -20℃下保存。
 

頁面更新：2019-10-18 08:59:22