SMART-Seq mRNA HT LP & SMART-Seq mRNA HT |
◆ 自動化友好型 - 兼容自動化工作站,更少的時間分析更多的樣本
◆ 高靈敏度 - 可以從單細(xì)胞或10 pg總RNA起始(起始量:1-100個細(xì)胞或10 pg-1 ng總RNA)
◆ 高質(zhì)量的RNA-Seq數(shù)據(jù) - 保留全長基因信息,低rRNA比率,高基因檢出數(shù),有效擴(kuò)增GC-rich轉(zhuǎn)錄本
◆ 單管操作流程 - SMART-Seq mRNA HT包含完整的cDNA合成和文庫構(gòu)建流程,分別在單管中進(jìn)行,減少樣品損失與混淆,降低手動操作誤差
◆ 增強(qiáng)的測序性能 - SMART-Seq mRNA HT搭配使用整合雙端特殊index(UDI),即便多個文庫pool后用高通量型Illumina測序儀(如Novaseq)分析,也能得到正確結(jié)果
◆ 更高的文庫產(chǎn)量 - 更便于使用高通量型Illumina測序儀測序(如Novaseq),或保存剩余的文庫用于多次測序
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■ 產(chǎn)品說明: |
SMART-Seq mRNA HT和SMART-Seq mRNA HT LP均兼容自動化移液工作站,采用oligo(dT)引物,支持1-100個細(xì)胞或10 pg-1 ng總RNA起始,合成高品質(zhì)的全長cDNA。SMART-Seq mRNA HT包含核心cDNA合成試劑,SMART-Seq mRNA HT LP在此基礎(chǔ)上,同時包含文庫構(gòu)建試劑,并且搭配Unique Dual Index kits(單獨購買)使用,最多可以制備384個Illumina測序文庫。
SMART-Seq mRNA HT具有簡化的操作流程,可用于FACS下游,并且由于引入了一步RT-PCR擴(kuò)增步驟,從而減少了手動操作時間。本試劑的核心技術(shù)-SMART技術(shù)(Switching Mechanism at 5′ End of RNA Template),是一種對全轉(zhuǎn)錄組研究,以及包括細(xì)胞內(nèi)剪接位點、可變剪接研究的強(qiáng)大的工具,并且可以檢測全長基因。Oligo(dT)可用于從高品質(zhì)總RNA(RIN> 8)或完整細(xì)胞中特異性擴(kuò)增mRNA。通過采用LNA技術(shù),提升了模板轉(zhuǎn)換的效率與基因檢出數(shù)等性能。
SMART-Seq mRNA HT LP在包含核心的cDNA合成試劑基礎(chǔ)上,同時整合了文庫構(gòu)建技術(shù),提供完整的單細(xì)胞cDNA合成到文庫構(gòu)建的實驗體驗。建庫試劑中包含片段化酶,以實現(xiàn)對合成cDNA的片段化,接著利用特別的莖環(huán)形接頭構(gòu)建高品質(zhì)Illumina文庫。在建庫階段,單管兩步操作、過程中無需純化、2 h即可建成文庫!
如果是以隨機(jī)引物起始,對少量細(xì)胞或者降解的Total RNA樣本進(jìn)行RNA-Seq分析時,推薦使用SMART-Seq® Total RNA Single Cell (ZapR™ Mammalian)。 |
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■ 實驗流程概要: |
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圖1. SMART-Seq mRNA HT LP的技術(shù)流程 |
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■ 數(shù)據(jù)展示: |
注:SMART-Seq mRNA HT LP和SMART-Seq mRNA HT是SMART-Seq HT PLUS Kit和SMART-Seq HT Kit的等效替代品。
以下展示來源于SMART-Seq HT Kit和 SMART-Seq HT PLUS Kit的數(shù)據(jù)。 |
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● SMART-Seq HT有更簡潔的操作流程 |
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圖2. SMART-Seq v4和SMART-Seq HT工作流程的比較 |
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SMART-Seq HT(右)是由SMART-Seq v4方法(左)改進(jìn)而來的一個手動操作時間更短的高通量工作流程。使用FACS方法獲得單細(xì)胞,SMART-Seq HT試劑盒只需3個操作步驟即可制備cDNA,而SMART-Seq v4試劑盒需要6步。SMART-Seq HT工作流程的一個重要步驟是一步RT-PCR,即使用一步RT-PCR緩沖液,進(jìn)行高效的反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增cDNA的過程。 |
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● SMART-Seq HT和SMART-Seq v4之間的基因表達(dá)分析比較 |
Sequencing metrics comparing SMART-Seq v4 and SMART-Seq HT kits |
RNA source |
10 pg Mouse Brain Total RNA |
cDNA synthesis |
SMART-Seq v4 |
SMART-Seq HT |
Replicate |
A |
B |
C |
A |
B |
C |
Yield (ng) |
7.3 |
8.5 |
9.4 |
9.5 |
9.9 |
9.2 |
Number of
transcripts |
14,168 |
13,934 |
14,147 |
14,510 |
14,650 |
14,553 |
11,455 |
11,267 |
11,349 |
11,582 |
11,670 |
11,454 |
Number of
transcripts |
14,168 |
13,934 |
14,147 |
14,510 |
14,650 |
14,553 |
Average
Pearson/Spearman |
0.97/0.67 |
0.97/0.68 |
0.96/0.66 |
Proportion of reads mapped (%) |
rRNA |
0.7 |
0.6 |
0.5 |
1.1 |
1.1 |
1.1 |
Mitochondria |
2.8 |
4.2 |
4.1 |
3.7 |
3.8 |
4.2 |
Genome |
92.3 |
90.8 |
86.6 |
89.1 |
89.0 |
87.8 |
Exons |
74.8 |
72.5 |
69.0 |
67.3 |
67.1 |
65.3 |
Introns |
13.3 |
14.1 |
13.3 |
16.9 |
16.9 |
17.4 |
Intergenic regions |
4.2 |
4.2 |
4.4 |
4.9 |
5.0 |
5.2 |
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分別使用SMART-Seq v4和SMART-Seq HT從10 pg小鼠腦總RNA制備cDNA后,使用Illumina的Nextera XT DNA Sample Prep Kit制備文庫,之后在NextSeq上進(jìn)行測序(2 x 75 bp)。結(jié)果顯示,使用SMART-Seq v4和SMART-Seq HT試劑盒鑒定的轉(zhuǎn)錄本高度重疊。
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● 從高靈敏度、高重復(fù)性的cDNA合成出發(fā),構(gòu)建更高品質(zhì)Illumina文庫 |
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(比較數(shù)據(jù)來源于Takara Bio USA, Inc.) |
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Takara科學(xué)家從10 pg小鼠腦total RNA起始,采用SMART-Seq HT完成cDNA合成。隨后分別使用SMART-Seq Library Prep Kit(SSlp)與市面上較常用的A公司試劑盒構(gòu)建文庫,并比較性能差異。
從測試數(shù)據(jù)中可以看出,SS-HT PLUS Kit所建文庫的產(chǎn)量是A公司Kit產(chǎn)量的5倍,而更高的文庫產(chǎn)量更適于高通量型Illumina測序儀,如Novaseq。
兩種方法所建文庫隨后用Nextseq 500完成測序,并對TPM(Transcripts per million)≥0.1的基因數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計。SS-HT PLUS文庫能比A公司文庫多檢出10%的基因,從同樣的cDNA起始能“捕獲”更全的信息!
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