| 抗體的快速高通量純化 |
| 在抗體藥物研發(fā)的初期，研究人員需要預(yù)測(cè)和篩選大量的抗體藥物靶標(biāo)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的靶點(diǎn)，然后摸索優(yōu)化培養(yǎng)條件，從眾多雜交瘤細(xì)胞中篩選出陽性克隆、檢測(cè)抗體親和力和特異性等。這一系列的過程都離不開抗體純化的操作步驟，但常規(guī)樹脂純化方法預(yù)處理和純化時(shí)間長(zhǎng)，柱床體積大，并且對(duì)操作環(huán)境和操作設(shè)備都有較高要求，不便于開展大規(guī)模小量樣品的篩選和驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，往往成為限速步驟，即使是選擇操作較為簡(jiǎn)便、耗時(shí)較短的磁珠純化法，也難免實(shí)驗(yàn)前要對(duì)磁珠進(jìn)行分裝、預(yù)處理，實(shí)驗(yàn)中要進(jìn)行的孵育以及頻繁的移液操作，在進(jìn)行高通量篩選時(shí)，人力和時(shí)間仍是捉襟見肘！因此，如果能將純化步驟提速，對(duì)抗體藥物臨床前研發(fā)的進(jìn)程將會(huì)有巨大的推動(dòng)作用。 Takara的Capturem Protein A 和Protein G系列產(chǎn)品可以為抗體純化提供快速高通量的解決方案。該系統(tǒng)基于Capturem膜技術(shù)，膜上偶聯(lián)能夠特異性的與IgG的Fc片段結(jié)合的ProteinA或ProteinG，可滿足抗體小量快速純化和96 well大規(guī)模快速篩選，兼具快速、易用、靈活和高產(chǎn)量（與同等體積樹脂比較）等特點(diǎn)。 |
| 【原理對(duì)比】 |
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| *ProteinA、ProteinG與抗體的結(jié)合能力根據(jù)抗體同種型（isotype）的不同而不同，實(shí)際產(chǎn)量受樣品類型、物種和抗體同種型影響。 |
| 【實(shí)驗(yàn)操作流程】 |
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| 使用Capturem Protein A會(huì)使工作流程更加連貫，減少抗體純化和篩選的工作量，從而產(chǎn)生高質(zhì)量的抗體。操作過程就如同提質(zhì)粒般簡(jiǎn)單，每步操作之間進(jìn)行1 min離心，小量純化的總凈化時(shí)間僅為5 min，96 well高通量純化可在15 min內(nèi)完成。膜的柱床體積<3μl，超過80％的抗體可以用低至100μl的洗脫液實(shí)現(xiàn)高濃度洗脫。 |
| 【實(shí)驗(yàn)案例】 |
| 使用Capturem Protein A技術(shù)快速篩選雜交瘤以獲得最佳Cas9單克隆抗體實(shí)例 |
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| 圖A，SDS-PAGE 凝膠電泳檢測(cè)不同克隆子的Capturem純化產(chǎn)物。圖B，將Cas9表達(dá)量低(lane #1)和高(lane #2)的細(xì)胞裂解液分別進(jìn)行凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，再使用Capturem™ Protein A Maxiprep純化得到的抗體對(duì)其進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)。圖C，使用篩選到的Cas9抗體，對(duì)不同比例稀釋(從左至右: 20 ng, 10 ng, 5 ng, 2.5 ng, 1.25 ng, 0.625 ng)的Cas9 蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)。由上圖可以看出，使用Capturem Protein A技術(shù)能在短時(shí)間內(nèi)高效的對(duì)多個(gè)轉(zhuǎn)化子所表達(dá)的抗體進(jìn)行純化和篩選。 Capturem膜技術(shù)法能夠顯著縮短操作時(shí)間，增加通量，其易用性能讓實(shí)驗(yàn)新人更快熟悉操作流程，保證數(shù)據(jù)重復(fù)性。 |
| 【擴(kuò)展應(yīng)用】 |
| 使用Capturem柱上快速標(biāo)記抗體 |
| 標(biāo)記抗體（Abs）是研究人員擴(kuò)大抗體應(yīng)用的關(guān)鍵方法之一，抗體-藥物偶聯(lián)物就是其中一種，近年來發(fā)展迅速。傳統(tǒng)的偶聯(lián)方法需要純化的起始材料以及較長(zhǎng)的孵育時(shí)間，為了改進(jìn)這一過程，我們利用了Capturem技術(shù)，可直接對(duì)未純化的起始材料進(jìn)行快速的柱上偶聯(lián)，從而在15分鐘內(nèi)標(biāo)記抗體。 |
| 直接在任意起始溶液中快速標(biāo)記抗體的工作流程 |
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| 熒光素標(biāo)記抗體的結(jié)果 |
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| 以含有小鼠Cas9抗體的雜交瘤培養(yǎng)基為起始材料（150 μg抗體），使用熒光素-NHS共軛物在Capturem Protein G Miniprep Columns上進(jìn)行快速抗體標(biāo)記，最終獲得40 μg熒光標(biāo)記抗體。nc：負(fù)對(duì)照；泳道1：12當(dāng)量反應(yīng)；泳道2：20當(dāng)量反應(yīng)；泳道3：50當(dāng)量反應(yīng)；泳道4：100當(dāng)量反應(yīng)。右圖表示每個(gè)泳道都有相等質(zhì)量的抗體，左圖表示熒光信號(hào)隨標(biāo)記反應(yīng)中熒光素濃度的增加而增加。 |
| 生物素標(biāo)記抗體的結(jié)果 |
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| 生物素標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)方案與熒光素標(biāo)記的相同，但使用生物素-NHS作為標(biāo)記試劑。左圖為標(biāo)記抗體的Western Blot結(jié)果，表明>90%的生物素標(biāo)記抗體可在前兩步洗脫操作中獲得。右圖為使用生物素標(biāo)記的抗體對(duì)重組Cas9 (rCas9)進(jìn)行Western Blot檢測(cè)的結(jié)果，表明使用Capturem Protein G Miniprep進(jìn)行柱上標(biāo)記和洗脫后，結(jié)合表位仍然保持活性。 |
| 【Capturem快速操作視頻】 |
| 相關(guān)產(chǎn)品 |
頁面更新：2020-04-22 09:18:53
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