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機(jī)構(gòu)用戶解決方案

產(chǎn)品選擇指南

技術(shù)服務(wù)信息

當(dāng)前位置：首頁> 解決方案 > 抗體藥物篩選解決方案 > 抗體藥物篩選解決方案 > 方案四：質(zhì)譜檢測前抗體的快速酶解消化
 
質(zhì)譜檢測前抗體的快速酶解消化
質(zhì)譜（MS）是蛋白質(zhì)組學(xué)中對(duì)來自多種生物和細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)進(jìn)行表征分析的主要技術(shù)，隨著LC-MS/MS技術(shù)在蛋白質(zhì)類藥物生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用，已可將方法開發(fā)周期從以前的2-3個(gè)月縮短為1周，而使用質(zhì)譜對(duì)抗體藥物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性以及定量也已經(jīng)成為抗體藥物研發(fā)過程中必不可少的環(huán)節(jié)。
質(zhì)譜分析中最重要的步驟是樣品制備，需要將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為肽。胰蛋白酶的使用是酶解消化蛋白質(zhì)以制備肽進(jìn)行分析最常用的手段。它是一種高度特異性的絲氨酸蛋白酶，在賴氨酸和精氨酸殘基的羧基側(cè)切割，產(chǎn)生MS分析最佳大小的肽。因此，快速和完全消化對(duì)于詳細(xì)的蛋白質(zhì)表征分析非常重要。
目前傳統(tǒng)的樣品制備操作是在溶液中37℃過夜進(jìn)行胰蛋白酶消化。蛋白質(zhì)的長時(shí)間消化可能造成氧化或其他蛋白質(zhì)修飾，導(dǎo)致靈敏度差，從降低了溶液內(nèi)消化的可重復(fù)性，并且也不適合自動(dòng)化平臺(tái)。此外，產(chǎn)生的信號(hào)肽的多少以及長短會(huì)直接影響到檢測方法的準(zhǔn)確性和靈敏度，從而影響了對(duì)抗體的定量及鑒定。
Takara的Capturem™ Trypsin和Pepsin可快速、有效、完全地消化蛋白質(zhì)樣品，在室溫下讓MS工作流程更加連貫。該系列產(chǎn)品應(yīng)用我們的新型Capturem膜技術(shù)，膜上固定有胰蛋白酶（Trypsin）或胃蛋白酶（Pepsin），僅需2-3分鐘的時(shí)間即可高效消化蛋白質(zhì)樣品，能進(jìn)行獨(dú)立樣品酶解，也可進(jìn)行96-well的高通量酶解操作。不僅可以節(jié)省時(shí)間，還可以通過減少胰蛋白酶自溶來改善蛋白質(zhì)組學(xué)分析中肽和蛋白質(zhì)的鑒定。
 
【實(shí)驗(yàn)案例】
Capturem™ Trypsin消化全細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
 
Protein amount per fraction used for Capturem Trypsin digestion
Fraction Protein amount (μg) Fraction Protein amount (μg)
1 32.22 11 35.19
2 35.08 12 33.12
3 33.75 13 26.88
4 41.76 14 31.88
5 41.76 15 29.41
6 38.21 16 26.48
7 38.21 17 25.98
8 38.40 18 24.63
9 30.32 19 21.48
10 35.23    
 
使用Capturem Trypsin對(duì)由BT474導(dǎo)管乳腺癌細(xì)胞制成的全細(xì)胞裂解物進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以盡可能多的鑒定獨(dú)特蛋白質(zhì)。變性的全細(xì)胞裂解物通過RP-HPLC（上圖， A）被分成獨(dú)立的19份，對(duì)每份用Capturem Trypsin消化。上表中提供了使用Capturem Trypsin消化的每份的蛋白質(zhì)含量。針對(duì)每份消化的蛋白質(zhì)進(jìn)行單獨(dú)的LC / MS-MS分析。上圖，B顯示了每份樣品鑒定得到的獨(dú)特的蛋白質(zhì)的數(shù)量。最終，使用Capturem™ Trypsin對(duì)BT474細(xì)胞酶解消化后進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析共鑒定得到了2,320種獨(dú)特蛋白質(zhì)。
 
Capturem™ Trypsin在進(jìn)行高通量酶解消化時(shí)的孔重復(fù)性
隨機(jī)選取Capturem™ Trypsin 96 well plate的3個(gè)孔，在天然條件下消化80 μg的apomyoglobin，消化過程僅用了2-3 min。由上圖可見，3個(gè)孔的酶解產(chǎn)物生成了相似的HPLC圖譜，這說明Capturem™ Trypsin酶解消化的產(chǎn)物具有良好的重復(fù)性，進(jìn)而證明產(chǎn)品具有良好的孔間一致性，非常適合質(zhì)譜檢測前抗體的高通量酶解消化。
 
【用戶感言】
Dr. Michelle R. Robinson來自美國默克(MERCK) 制藥公司，默克研究所藥代動(dòng)力學(xué)及藥效動(dòng)力學(xué)部門。
他在研究簡報(bào)中提到，免疫親和純化和酶消化處理是使用金標(biāo)準(zhǔn)“自下而上（bottom-up）”法進(jìn)行LC-MS分析前，廣泛使用且至關(guān)重要的樣品處理步驟。如果應(yīng)用Capturem技術(shù)進(jìn)行免疫親和純化和酶消化處理，將大大縮短實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間。他以兩種單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品為樣品，使用Capurem進(jìn)行免疫親和純化和酶解消化，再進(jìn)行LC-MS定量分析以評(píng)估Capturem的使用效果，結(jié)果酶消化步驟由傳統(tǒng)溶液法的4-18 hr縮短成3 min，而使用原有的自動(dòng)操作系統(tǒng)進(jìn)行免疫親和純化最快也需要2 hr，使用Capturem則僅需5 min。除此之外，Capturem還能夠顯著增加實(shí)驗(yàn)通量達(dá)10-20倍。
Takara的SMARTer cDNA合成技術(shù)、In-Fusion克隆技術(shù)以及Capturem™ 膜技術(shù)在抗體藥物研究領(lǐng)域的應(yīng)用，大大縮短了藥物在篩選和DMPK研究階段的實(shí)驗(yàn)周期，為實(shí)現(xiàn)藥物研發(fā)與疾病“賽跑”提供了可能！
 
 
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頁面更新：2019-11-27 14:20:42