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機構(gòu)用戶解決方案

產(chǎn)品選擇指南

技術(shù)服務(wù)信息

當前位置：首頁> 產(chǎn)品選擇指南 > 蛋白質(zhì)互作研究（酵母雜交系統(tǒng)） > Takara酵母雜交學(xué)習(xí)中心 > 酵母雜交應(yīng)用：蛋白質(zhì)互作與快速驗證應(yīng)用
無標題文檔
 
    蛋白質(zhì)在功能上的作用不是單個蛋白質(zhì)孤立完成的，而是通過與其他蛋白質(zhì)相互作用來完成的。在時間上，一個蛋白質(zhì)可能需要順序性地與多個蛋白質(zhì)相互作用；在空間上，一個蛋白質(zhì)可能與其他若干個蛋白質(zhì)組裝成為復(fù)合體執(zhí)行功能。因此，鑒別蛋白質(zhì)相互作用是研究蛋白質(zhì)功能的基礎(chǔ)性工作。
    在相互作用持續(xù)時間上，蛋白質(zhì)相互作用可以是持久性的也可以是短暫的，比如負責(zé)基因信息維護的酶很多是持久性地結(jié)合，比如在代謝過程中一些酶的相互作用就是相對瞬時性的；在相互作用的結(jié)合強度上，蛋白質(zhì)相互作用可以是結(jié)合力強的，也可以是弱結(jié)合力的；有些方法是在體外進行判定（in vitro analysis），而有些方法是體內(nèi)判定(in vivo analysis)。 因此，研究蛋白質(zhì)相互作用往往需要配合使用若干種方法。
 
蛋白質(zhì)互作研究常規(guī)方法 產(chǎn)品名稱
  相互作用持續(xù)時間   相互作用強度   體內(nèi)判定/體外判定
酵母雜交   持久或瞬時   強或弱   體內(nèi)
免疫共沉淀   持久   強   體內(nèi)
GST-Pull down   持久   強   體外
蛋白質(zhì)交聯(lián)（cross linking）   瞬時   弱   體外
 
【酵母雙雜交技術(shù)】
    酵母雙雜交技術(shù)是由Fields和Song在1989年提出的。該技術(shù)的產(chǎn)生是基于對酵母細胞的轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)的研究。轉(zhuǎn)錄因子GAL4包括兩個結(jié)構(gòu)域，分別是位于N端的DNA結(jié)合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位于C端的轉(zhuǎn)錄激活域（Activati on domain，AD)。DNA-BD能夠識別并結(jié)合于GAL4效應(yīng)基因（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)。而AD則是通過與轉(zhuǎn)錄機構(gòu)（transcriptionmachinery）中的其他成分之間的結(jié)合作用，以啟動UAS下游的基因進行轉(zhuǎn)錄。當DNA-BD和AD分開獨立存在時，并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，只有當二者在空間距離非常接近時，才會呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性并可激活UAS下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。根據(jù)這個特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建在同一個表達載體上，所獲得的融合蛋白質(zhì)叫做誘餌蛋白質(zhì)（bait）；將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在另一個表達載體上，所得到的融合蛋白質(zhì)叫做獵物蛋白質(zhì)（prey）。Bait和prey發(fā)生相互作用，形成完整的轉(zhuǎn)錄因子GAL4，使酵母菌基因組的效應(yīng)基因表達。
 
 
技術(shù)優(yōu)點：
1. 蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生在細胞內(nèi)，蛋白質(zhì)無需純化，并且可以在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況；
2. 適于大規(guī)模篩選，用已知的蛋白質(zhì)從cDNA文庫中調(diào)取具有相互作用的蛋白質(zhì)；
3. 可以檢測出存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或瞬時的相互作用。
 
技術(shù)局限性：
假陽性：假陽性是指兩個待測蛋白質(zhì)本沒有相互作用，但實驗卻顯示陽性結(jié)果。例如，由于某些蛋白質(zhì)本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達時發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白質(zhì)在無特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下就可以激活效應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄。另外，某些蛋白質(zhì)表面含有對多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域，能與其他蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物從而引起報告基因的表達，產(chǎn)生"假陽性"結(jié)果。
 
【免疫共沉淀技術(shù)】
    免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP），是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)，用于確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。當細胞在非變性條件下被裂解時，細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。傳統(tǒng)的Co-IP方法通常是用能夠與瓊脂糖珠上偶聯(lián)的protein A特異性結(jié)合的抗體免疫沉淀A蛋白質(zhì)，那么與A蛋白質(zhì)在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來，以此來驗證預(yù)測的蛋白質(zhì)是否具有相互作用。
 
 
技術(shù)優(yōu)點：
1. 相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；
2. 與酵母雜交技術(shù)相同，蛋白質(zhì)的相互作用是在細胞內(nèi)進行的，避免外界環(huán)境影響；
3. 實驗流程比酵母雜交的方法要簡單快速。
 
技術(shù)局限性：
1. 靈敏度要比酵母雜交方法低，可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；
2. 必須在實驗前對互作蛋白質(zhì)進行預(yù)測，以選擇最后檢測的抗體，所以若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果；
3. 篩選效率低，無法像酵母雙雜交的方法一樣從大量的未知的蛋白質(zhì)中調(diào)出具有相互作用的蛋白質(zhì)。
 
    Clontech品牌的兩款技術(shù)領(lǐng)先型產(chǎn)品，結(jié)合各自的優(yōu)勢特點并互補不足之處，為研究強度較大的蛋白質(zhì)相互作用提供了文庫級別的篩選和鑒別驗證的可靠解決方案。首先，酵母雜交產(chǎn)品線Matchmaker系列，可以用于體內(nèi)大規(guī)模的初步篩選蛋白質(zhì)相互作用候選目標。其次，Clontech品牌特有的CapturemTM技術(shù)，實現(xiàn)了基于膜上的蛋白質(zhì)捕獲，從而使得免疫共沉淀純化部分的操作時間從傳統(tǒng)的數(shù)個小時減少到5分鐘左右，使實驗效率顯著提高。
 
實驗流程示意圖：
 
 
1. 自己構(gòu)建酵母雙雜交文庫
DIY文庫，簡便而且快速。
    您可使用Make Your Own Mate & Plate Library System（630490）自己制作文庫。利用該系統(tǒng)，一周之內(nèi)即可構(gòu)建足夠用于數(shù)百次酵母雙雜交篩選實驗的所需文庫。文庫構(gòu)建是在Y187文庫酵母菌株中通過酵母高效的同源重組機制直接完成的，無需進行傳統(tǒng)文庫構(gòu)建過程中的一些繁冗的操作 (比如文庫克隆、擴增和大腸桿菌收集等)。
 
技術(shù)原理
 
 
    本系統(tǒng)利用Clontech品牌的SMART cDNA合成技術(shù)，使用任意組織來源的少至100 ng的總RNA，即可構(gòu)建cDNA文庫。SMART技術(shù)利用了MMLV (Moloney murine leukemia virus) RT的末端轉(zhuǎn)移酶活性和模板轉(zhuǎn)換機制，合成的一鏈cDNA序列末端含有已知的通用引物結(jié)合位點。因此，SMART一鏈cDNA可以通過PCR進行擴增，然后與具有末端同源序列的Matchmaker Gold 獵物載體pGADT7-Rec進行重組。基于以上特征，使用納克級的RNA (例如來源于顯微解剖組織、激光捕獲細胞或者活檢樣品) 即可合成cDNA，共轉(zhuǎn)化這些cDNA和pGADT7-Rec到酵母菌株Y187中，即可直接構(gòu)建文庫。
 
Make Your Own "Mate & Plate"™Library System（630490）制品特點
· 利用SMART™技術(shù)在酵母中直接構(gòu)建文庫
· 無需繁瑣的克隆或文庫擴增
· 足夠用于數(shù)百次的雙雜交篩選
 
2. 文庫蛋白質(zhì)篩選方法
Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System（630489）
    Matchmaker Gold酵母雙雜交系統(tǒng)是酵母雙雜交實驗進行大規(guī)模文庫蛋白質(zhì)篩選方法的核心工具，系統(tǒng)中包含專門用于酵母雙雜交實驗的工程菌株Y2H Gold，具有更加嚴謹?shù)暮Y選報告基因；采用巧妙的設(shè)計將誘餌蛋白質(zhì)與文庫蛋白質(zhì)構(gòu)建到不同類型的酵母菌中，利用酵母菌接合反應(yīng)實現(xiàn)文庫篩選，方便于在百萬級別的文庫中調(diào)取互作蛋白質(zhì)，實現(xiàn)真正意義上的大規(guī)模的互作蛋白質(zhì)篩選。
 
Matchmaker酵母雙雜交系統(tǒng)的功能
· 發(fā)現(xiàn)新的與已知蛋白質(zhì)互作的蛋白質(zhì)
· 確認兩個蛋白質(zhì)之間的相互作用
· 鑒定參與蛋白質(zhì)相互作用的區(qū)域
 
技術(shù)原理：
    在基于GAL4的Matchmaker酵母雙雜研究中，bait蛋白質(zhì)與GAL4的DNA結(jié)合域（BD）融合表達，而作為文庫的prey蛋白質(zhì)與GAL4的激活結(jié)構(gòu)域（AD）融合表達。當bait蛋白質(zhì)與庫（prey）蛋白質(zhì)有相互作用時，DNA-BD與AD之間相互接近從而激活4個相互獨立的報告基因（AUR1-C、 ADE2、HIS3和 MEL1）的表達。
 
 
    4個報告基因：Matchmaker Gold雙雜交系統(tǒng)采用1個AbA抗生素篩選報告基因、2個營養(yǎng)篩選報告基因、1個藍白斑篩選報告基因。
    當酵母雙雜系統(tǒng)只采用HIS3營養(yǎng)報告基因篩選蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作時，經(jīng)常會獲得大量的背景克隆和假陽性。背景克隆是由于營養(yǎng)報告基因泄露表達引起的，而假陽性是由于prey蛋白質(zhì)無需與bait蛋白質(zhì)互作即可識別和結(jié)合報告基因上游序列引起的。
    Matchmaker Gold系統(tǒng)是采用4個報告基因/3個不同bait識別序列的雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用新型的、穩(wěn)定的酵母菌抗生素AbA，可以有效殺死非抗性克隆，從而大大降低了背景克隆的生長。4種報告基因同時作用，假陽性出現(xiàn)的概率大大降低。
 
Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System（630489）制品特點
· 較低的假陽性率
· 4個報告基因，包括Aureobasidin A（AbA）抗生素抗性篩選基因
· 簡便的“Mating”接合方法
 
3. 應(yīng)用高效的Capturem™ 膜技術(shù)對蛋白質(zhì)相互作用進行 Co-IP驗證
Capturem™ IP & Co-IP Kit（635721）
    Capturem™ IP & Co-IP Kit基于傳統(tǒng)Co-IP方法的技術(shù)原理，其創(chuàng)新之處在于采用特殊工藝將protein A作為配基固定在膜上，使純化介質(zhì)由一定體積的樹脂變成一層薄膜，大大降低了柱床體積，從而大幅度縮短實驗時間，并提高純化效果。
 
Capturem™ IP & Co-IP Kit（635721）制品特點
· 簡單和快速的實驗流程：抗體與樣品孵育，之后在室溫下進行的純化僅需5 min
· 完整的解決方案：kit中包含用于IP和Co-IP實驗的Capturem™ Protein A純化柱和buffer，且均經(jīng)過優(yōu)化
· 高濃度：洗脫液體積小，產(chǎn)物濃度高
· 高質(zhì)量：樣品在膜上停留時間短，避免復(fù)合物的凝集、解體或失活
· 通用性強：兼容寬泛的IP buffer和實驗條件
· 一次性使用：基于新型膜技術(shù)的一次性離心柱，能避免污染
 
Capturem™ 方法Co-IP實驗技術(shù)流程：
 
 
    從流程圖中可以看出，抗體與蛋白質(zhì)裂解液孵育后，從上樣到洗脫純化，僅需5 min就可以得到高質(zhì)量的抗體-蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物。由于樣品在Capturem™ 膜上停留的時間短，所以可以很大程度地避免了復(fù)合物的凝集、解體或失活，從而提高驗證實驗的成功率。
    需要注意的是，如果沒有合適的與天然蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體，可以考慮為目標蛋白質(zhì)添加標簽，如Myc、HA、Flag等，之后采用標簽對應(yīng)的抗體進行Co-IP實驗。由于這些標簽分子量都很小，所以一般不會對蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生影響。Clontech品牌提供多種標簽蛋白質(zhì)表達載體和相應(yīng)的標簽抗體，可以滿足您在實驗上的多種需求。
 
 
 

頁面更新：2021-12-28 11:50:33