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選對(duì)sgRNA，CRISPR實(shí)驗(yàn)成功率更有保證

北京時(shí)間2020年10月7日，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)揭曉。法國(guó)科學(xué)家埃馬紐爾·夏彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和美國(guó)科學(xué)家詹妮弗·杜德納（Jennifer A.Doudna）獲此殊榮，以表彰她們?cè)诮陙砘馃岬腃RISPR/Cas9基因編輯方面的貢獻(xiàn)，這項(xiàng)簡(jiǎn)便的基因編輯技術(shù)對(duì)生命科學(xué)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。

在CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)中，將Cas9核酸酶靶向基因組特定位點(diǎn)，是通過由用戶定義的sgRNA介導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)的。對(duì)于sgRNA設(shè)計(jì)，現(xiàn)在有許多sgRNA網(wǎng)絡(luò)在線設(shè)計(jì)工具，雖然這些工具采用的方法不同，但大多數(shù)設(shè)計(jì)工具的宗旨都是提供高靶標(biāo)特異性，低脫靶效應(yīng)的sgRNA序列。我們整理了一些sgRNA在線設(shè)計(jì)工具資源以及它們的基本特點(diǎn)，大家可以點(diǎn)擊鏈接查看了解。

借助這些在線設(shè)計(jì)工具，可以獲得針對(duì)某個(gè)特定靶標(biāo)基因的多個(gè)候選sgRNA。然而，盡管運(yùn)用了生物信息學(xué)對(duì)所提供的候選sgRNA進(jìn)行了預(yù)測(cè)，但并非每條sgRNA都具有同等的切割效率。鑒于這種不一致性，對(duì)多條sgRNA進(jìn)行篩選，從中找到切割效率最高的一條是很有必要的。

不同sgRNA所展現(xiàn)的切割效率不同。

以使用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)敲除HeLa細(xì)胞CXCR4基因?yàn)槔?em>CXCR4基因編碼一種與CXCL12趨化因子相互作用的細(xì)胞表面趨化因子受體，它在免疫系統(tǒng)中起重要作用。在本實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)CXCR4基因設(shè)計(jì)并合成了4條不同的sgRNA，使用Guide-it sgRNA Screening Kit測(cè)試了這4條sgRNA的體外切割效率。簡(jiǎn)單來講，就是使用Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit合成了4條針對(duì)CXCR4基因的sgRNA，然后將含有sgRNA靶序列的PCR片段和重組Cas9蛋白質(zhì)分別與每條sgRNA混合，建立4個(gè)體外切割反應(yīng)。反應(yīng)完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳方法分析每個(gè)切割反應(yīng)中sgRNA的切割效率。密度測(cè)定（Cong et al., 2013）結(jié)果顯示，sgRNA3的切割效率最低（sgRNA1: ～55；sgRNA2: ～42%；sgRNA3: ～8%；sgRNA4: ～71%）。

通過體外切割效率可預(yù)測(cè)體內(nèi)切割情況。

將上面所測(cè)試的四種不同sgRNA分別與編碼Cas9的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，基因編輯后使用Guide-it Mutation Detection Kit分析CXCR4基因突變情況。這種測(cè)定方法使用了解離酶Guide-it Resolvase，它是一種特異性切割錯(cuò)配序列的核酸酶，可以用來鑒定基因編輯后細(xì)胞中特定位點(diǎn)的插入或缺失突變。從檢測(cè)結(jié)果來看，在轉(zhuǎn)染了sgRNA1、sgRNA2和sgRNA4的細(xì)胞中可以高效檢測(cè)到錯(cuò)配序列。但是，在轉(zhuǎn)染sgRNA3的細(xì)胞中所檢測(cè)到的錯(cuò)配率是非常低的，這與上面使用Guide-it sgRNA Screening Kit所預(yù)測(cè)的sgRNA切割效率結(jié)果是一致的。

還通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估了CXCR4基因敲除效率。由于CXCR4是一種細(xì)胞表面受體，因此使用FITC標(biāo)記的CXCR4抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)可以對(duì)CXCR4進(jìn)行檢測(cè)。流式分析結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了Cas9和sgRNA1、sgRNA2和sgRNA4的細(xì)胞中可以檢測(cè)到CXCR4基因的正常表達(dá)受到破壞。然而，轉(zhuǎn)染了Cas9和sgRNA3的細(xì)胞，CXCR4表達(dá)受到破壞的比例要小得多。這些表達(dá)功能數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了Guide-it sgRNA Screening Kit和Guide-it Mutation Detection Kit所獲得的檢測(cè)結(jié)果。

以上檢測(cè)結(jié)果表明，Guide-it sgRNA Screening Kit預(yù)測(cè)的體外sgRNA切割效率，與通過插入/缺失基因突變和功能基因敲除所評(píng)估的sgRNA介導(dǎo)的體內(nèi)切割，這三者之間存在明顯的相關(guān)性。這也說明在CRISPR/Cas9基因編輯研究中，Guide-it sgRNA Screening Kit是篩選高效sgRNA的一種有效方法。在進(jìn)行細(xì)胞水平基因敲除實(shí)驗(yàn)之前，建議合成多個(gè)候選sgRNA，通常每個(gè)靶標(biāo)基因建議設(shè)計(jì)4～5條sgRNA，并從中篩選出高效的sgRNA用于基因編輯實(shí)驗(yàn)，這是非常必要的，可以大大地降低使用無效或者低效率sgRNA的風(fēng)險(xiǎn)。

■ Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit

通過體外轉(zhuǎn)錄方式簡(jiǎn)便制備高品質(zhì)sgRNA，方便獲得多個(gè)或者大量sgRNA用于后續(xù)篩選或者導(dǎo)入靶細(xì)胞，降低合成成本。

· 調(diào)整了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，sgRNA產(chǎn)量可達(dá)到約12 μg以上（約為以往產(chǎn)品的3倍）。
· 使用高保真酶PrimeSTAR Max擴(kuò)增模板DNA（sgRNA編碼模板），可以減少非特異性擴(kuò)增，原則上不需要切膠回收。
· 使用Clean-Up Kit柱純化方式純化sgRNA，無需進(jìn)行繁瑣的苯酚/氯仿抽提純化。

■ Guide-it sgRNA Screening Kit

在細(xì)胞水平進(jìn)行基因編輯之前，通過體外檢測(cè)方法預(yù)測(cè)sgRNA切割效率，降低使用無效或者低效率sgRNA的風(fēng)險(xiǎn)，提高成功率。

· 使用Terra PCR聚合酶擴(kuò)增目的DNA（DNA切割模板）。
· 可直接以細(xì)胞為起始進(jìn)行擴(kuò)增，無需提取基因組DNA。
· 包含Cas9蛋白質(zhì)溶液：高濃度、低甘油濃度、含有NLS（核定微信號(hào)）。

■ Guide-it Mutation Detection Kit

用于基因編輯后，在篩選細(xì)胞克隆前，檢測(cè)評(píng)價(jià)細(xì)胞群基因突變效率，提高細(xì)胞克隆篩選效率，檢測(cè)特異性和靈敏度高。All-in-one試劑盒，無需優(yōu)化，新手小白力薦。

· 通過PCR方法簡(jiǎn)單快速檢出細(xì)胞基因組中導(dǎo)入的插入、缺失突變。
· 除了檢測(cè)所需要的解離酶之外，還包含Terra PCR聚合酶和所需緩沖液。
· 使用Terra PCR聚合酶，可直接以細(xì)胞為起始進(jìn)行PCR擴(kuò)增，更快更高效。

除此之外，Takara還可以單獨(dú)提供高濃度無標(biāo)簽重組Cas9蛋白質(zhì)溶液，品質(zhì)高穩(wěn)定性好。與Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit所制備的sgRNA搭配使用，可在靶細(xì)胞中進(jìn)行RNP（Cas9-gRNA核糖核蛋白復(fù)合物）介導(dǎo)的基因編輯。我們可以提供研究級(jí)和GMP級(jí)兩種級(jí)別，讓您隨心應(yīng)對(duì)基礎(chǔ)科研和體外臨床應(yīng)用（僅限于研究），實(shí)現(xiàn)從研究到臨床試驗(yàn)（基于研究目的）的平穩(wěn)過渡。

產(chǎn)品	Code No.	包裝量
Guide-it Mutation Detection Kit	631448	25 次
Guide-it Mutation Detection Kit	631443	100 次
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit	632635	50 次
Guide-it Complete sgRNA Screening System	632636	50 次
Guide-it sgRNA Screening Kit	632639	50 次
Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl)	632640	100 μg x 3
Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl)	632641	100 μg

參考文獻(xiàn)：

1. Cong, L. et al. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas9 systems. Science 339 (6121):819-23.

頁面更新：2021-07-16 16:12:25

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