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機(jī)構(gòu)用戶解決方案

產(chǎn)品選擇指南

技術(shù)服務(wù)信息

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RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種利用小RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)來抑制基因表達(dá)的有效方法，在生物醫(yī)學(xué)研究中取得了重大進(jìn)展，特別是在通過干擾基因功能來解析基因型-表型關(guān)系方面。由于基于RNAi的工具和技術(shù)的激增，以及RNAi在需要瞬時基因敲除的特殊應(yīng)用中的獨特優(yōu)勢，RNAi仍然是現(xiàn)代生物學(xué)家的一個重要研究工具。
 
盡管CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯等新技術(shù)的發(fā)展，可能會使RNAi在特定應(yīng)用中的效用黯然失色，但這項重要的技術(shù)仍然被廣泛使用，具有高度的適用性。RNAi是一種雙鏈RNA介導(dǎo)的機(jī)制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，其工作原理是將雙鏈RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)加工成小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)或微RNA (microRNA/miRNA)。然后，這些小RNA與同源的mRNA結(jié)合，并通過RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex, RISC)誘導(dǎo)其降解。
 
miRNA的形成和調(diào)控機(jī)制
MicroRNA（miRNA）是一類長度為19-23nt的小型非編碼RNA，對植物和動物的基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，最先在秀麗隱桿線蟲中被發(fā)現(xiàn)，隨后被證明在人類等高等脊椎動物的基因組中編碼，以序列特異性方式作用于靶mRNA，以促進(jìn)其切割、降解或降低其翻譯效率。
miRNA的初級產(chǎn)物是pri-miRNA，它是一種至少包含一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)的長RNA轉(zhuǎn)錄本，在細(xì)胞核內(nèi)核糖核酸酶RNase III（即Drosha和DGCR8/Pasha）的作用下，生成前體miRNA（pre-miRNA）。隨后，pre-miRNA在Exportin-5復(fù)合物的作用下被轉(zhuǎn)運出細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中由Dicer酶剪切成為成熟的miRNA。成熟的miRNAs可通過Argonaute蛋白質(zhì)家族與RISC結(jié)合，從而導(dǎo)致靶mRNA降解或翻譯抑制（圖1描述了miRNA的形成和調(diào)控機(jī)制）。
 
 
siRNA的形成和調(diào)控機(jī)制
Small interfering RNA（siRNA）是一種小的外源性dsRNA，包含約20個核苷酸，在體外RNA干擾（RNAi）過程中人工合成或通過轉(zhuǎn)運體從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中。在秀麗隱桿線蟲中，dsRNA通過跨膜蛋白SID-1被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，再經(jīng)DCR-1處理形成雙鏈siRNA。這些雙鏈siRNA與RISC結(jié)合形成小干擾RISC（small interfering RISC, siRISC），然后通過解旋酶作用激活siRISC。隨后，激活的siRISC以序列特異性的方式作用于靶mRNA，導(dǎo)致互補(bǔ)靶mRNA降解，從而抑制翻譯過程（圖1描述了siRNA的形成和調(diào)控機(jī)制）。
 
miRNA和siRNA之間既有相似之處，比如長度均約為20個核苷酸，都由dsRNA產(chǎn)生，由Dicer酶切割參與RNAi過程。但二者也有許多不同之處，比如miRNA是單鏈小RNA，通過抑制翻譯而不是影響轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，而siRNA是雙鏈小RNA，通過在轉(zhuǎn)錄后水平上降解靶mRNA來調(diào)節(jié)基因表達(dá)等。面對miRNA和siRNA研究的巨大挑戰(zhàn)，Takara可為您提供多種研究方案，涵蓋small RNA的提取、克隆、定量、表達(dá)、siRNA合成、體外轉(zhuǎn)錄等相關(guān)產(chǎn)品，下面就讓我們一睹為快吧！
 
miRNA研究解決方案
 
Small RNA 提取
產(chǎn)品名稱 Code No. 包裝量
RNAiso for Small RNA 9753Q 25 ml
9753A 100 ml
 
產(chǎn)品特點：
1. 廣譜性強(qiáng)。可以從動物組織、植物材料、各種微生物、培養(yǎng)細(xì)胞等中提取Small RNA，包括tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、microRNA (miRNA) 和 siRNA。
2. 純度佳。提取的Small RNA純度高，基本可以除去28S和18S大片段RNA、蛋白質(zhì)及基因組DNA。提取的Small RNA適用于Northern blot analysis、Quantitative、Real Time RT-PCR、Microarray analysis等分子生物學(xué)實驗。
3. 快速簡便。實驗操作快速方便，整個操作在一小時內(nèi)便可完成。
4. 顏色鮮明。加入氯仿離心后，會形成無色的上清層和鮮紅色的下層 (有機(jī)層)。
 
 
Small RNA 克隆
產(chǎn)品名稱 Code No. 包裝量
pBApo-CMV Neo DNA 3240 20 μg
pBApo-CMV Pur DNA 3241 20 μg
pBApo-CMV DNA 3242 20 μg
pBApo-EF1α Neo DNA 3243 20 μg
pBApo-EF1α Pur DNA 3244 20 μg
 
產(chǎn)品特點：
1. 該系列載體是一類簡單的應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞的基因表達(dá)載體，具有單純皰疹病毒胸苷激酶來源的polyA信號。
2. 抗性篩選標(biāo)記是新霉素或嘌呤霉素。
3. 可用于前體microRNA的轉(zhuǎn)錄。
 
 
microRNA 定量PCR
產(chǎn)品名稱 Code No. 包裝量
  microRNA一步法cDNA合成試劑盒
Mir-X miRNA First Strand Synthesis Kit 638313 20 次
638315 60 次
  cDNA合成和microRNA定量二合一試劑盒
Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green® Kit 638314 200 次
638316 600 次
 
產(chǎn)品特點：
1. 通用的加A尾反轉(zhuǎn)錄原理，一次反轉(zhuǎn)樣品中的不同microRNA
2. 簡單的一步法cDNA合成系統(tǒng)，無需復(fù)雜的操作
3. 可使用同一RNA模板進(jìn)行不同microRNA的定量檢測，節(jié)省樣品用量
4. 試劑盒附帶通用的PCR下游引物，只需設(shè)計特異性的上游引物即可
5. 可對低至50 copies的microRNA進(jìn)行檢測，靈敏度高
6. 產(chǎn)品有獨立的反轉(zhuǎn)錄試劑盒和反轉(zhuǎn)定量二合一的試劑盒可供選擇，靈活性高
 
實驗原理：
Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green® Kit的原理是在單管中一步法合成第一鏈cDNA，然后使用miRNA特異性引物和TB Green試劑對cDNA進(jìn)行特異性的定量擴(kuò)增。在Mir-X cDNA合成反應(yīng)中，使用poly（A）聚合酶將RNA加A尾，然后使用修飾的oligo（dT）引物和SMART MMLV Reverse Transcriptase進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
 
 
Small RNA 克隆
產(chǎn)品名稱 Code No. 包裝量
pmRi-ZsGreen1 Vector 631121 20 μg
pmRi-mCherry Vector 631119 20 μg
 
產(chǎn)品特點：
Tet可誘導(dǎo)性哺乳動物表達(dá)載體，可產(chǎn)生microRNA與熒光蛋白質(zhì)（綠色熒光ZsGreen1/紅色熒光mCherry）共表達(dá)。
 
 
siRNA研究解決方案
 
siRNA 化學(xué)合成
siRNA(約20個堿基左右)的合成
RNA種類 合成量 合成周期
單鏈RNA ① 25 nmol 5～7 個工作日
雙鏈RNA ② 25 nmol 7～10 個工作日
注：① 凍結(jié)干燥品。 另附送1 ml 5 × Annealing Buffer和1 ml DEPC處理水。
5 × Annealing Buffer組成：
500 mM CH3COOK，150 mM HEPES-KOH (pH7.4)，10 mM (CH3COO)2Mg
② Annealing后的制品凍結(jié)溶液 (20 pmol/μl)，可直接用于轉(zhuǎn)染。
溶液組成：100 mM CH3COOK，30 mM HEPES-KOH (pH7.4) ，2 mM (CH3COO)2Mg
 
siRNA 體外轉(zhuǎn)錄
產(chǎn)品名稱 Code No. 包裝量
in vitro Transcription T7 Kit（for siRNA Synthesis） 6140 50 次
 
產(chǎn)品特點：
1. 包含實驗必備的關(guān)鍵酶（T7 RNA Polymerase、RNase T1）、Buffer、NTP、對照模板以及RNase Inhibitor。
2. 以試劑盒提供的20 ng Control Template為模板，可在20 μl體系中反轉(zhuǎn)錄合成約10 μg的2 kb單鏈RNA。
3. 操作靈活，步驟簡單，試劑盒中包含RNase T1，可特異性切斷單鏈RNA的鳥苷酸3'端磷酸，特別適合自制多個siRNA用于篩選性RNAi實驗。
 
合成的siRNA定量
產(chǎn)品名稱 Code No. 包裝量
Synthetic siRNA Quantitation Core Kit 6142 30 次
 
產(chǎn)品特點：
1. 對合成的siRNA進(jìn)行高靈敏度的定量。
2. 適用于3’末端帶有脫氧胸腺嘧啶d(TT)的siRNA的定量。
 
【實驗例】
方法：
在50 μl小鼠全血(檸檬酸鈉抗凝劑)中分別添加10 amol、1 fmol、100 fmol的Control siRNA后，使用RNAiso Plus (Code No.: 9108) 及Dr. GenTLE Precipitation Carrier (Code No.: 9094) 制備Total RNA (50 μl)。
使用本制品和TB Green Premix Ex Taq II (Perfect Real Time) 進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，對Control siRNA進(jìn)行定量檢測。
 
結(jié)果：
使用本制品，通過Real Time PCR解析方法，對于添加到小鼠血液中的siRNA進(jìn)行了定量。
圖5 小鼠血液樣品中摻入的Control siRNA定量結(jié)果
 
siRNA/ssRNA marker
產(chǎn)品名稱 Code No. 包裝量
siRNA Ladder Marker 3430 約25 次
14-30 ssRNA Ladder Marker 3416 約25 次
 
 
shRNA 表達(dá)
RNAi實驗的主要技術(shù)有合成的siRNA直接導(dǎo)入細(xì)胞的方法和表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA的方法，這兩種方法應(yīng)用比較普遍。合成的siRNA直接導(dǎo)入細(xì)胞的方法RNAi效果短暫；用表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA的方法，能夠獲得持續(xù)性的RNAi效果，一旦獲得了導(dǎo)入表達(dá)載體的細(xì)胞，就有可能獲得基因表達(dá)長期受抑制的效果。
 
因為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以在感染細(xì)胞的染色體上穩(wěn)定的重組目的基因，所以使用載體轉(zhuǎn)染方法獲得長期穩(wěn)定的RNA干擾作用是非常有效的。pSINsi載體系列是以自我復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體作為基本骨架，使用RNA polymerase III (pol III)系列的promoter表達(dá)hairpin型RNA。RNA polymerase III (pol III)系列promoter下游的克隆位點插入表達(dá)hairpin型RNA的合成寡核苷酸DNA，就可以獲得siRNA表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，以新霉素作為這種載體的抗性篩選基因。
 
產(chǎn)品名稱 Code No. 包裝量
pSINsi-hH1 DNA 3660 20 μg
pSINsi-hU6 DNA 3661 20 μg
pSINsi-mU6 DNA 3662 20 μg
 
pBAsi vector series是利用RNA polymerase III (pol III) 系列的promoter表達(dá)siRNA的質(zhì)粒載體。該質(zhì)粒搭載了新霉素抗性基因及嘌呤霉素抗性基因。可用于導(dǎo)入細(xì)胞的篩選。通過在pol III系列的promoter的下游插入表達(dá)hairpin型RNA的合成DNA序列可制備siRNA 表達(dá)質(zhì)粒。將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，即可用于RNAi實驗。
 
產(chǎn)品名稱 Code No. 包裝量
pBAsi-hH1 DNA 3220 20 μg
pSINsi-hU6 DNA 3221 20 μg
pBAsi-mU6 DNA 3222 20 μg
pBAsi-hH1 Pur DNA 3223 20 μg
pBAsi-hU6 Pur DNA 3224 20 μg
pBAsi-mU6 Pur DNA 3225 20 μg
pBAsi-hU6 Neo DNA 3227 20 μg
pBAsi-mU6 Neo DNA 3228 20 μg
 
 
 
 

頁面更新：2021-01-29 09:40:39