| TCR-Seq方法怎么選，一篇54分SCI文章的深度測評值得關(guān)注！ |
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| 或許您也注意到，最近幾年，國內(nèi)外越來越多的科研人員投身于免疫組庫研究的陣營。通過了解T細(xì)胞，研究人員可以洞悉免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性。研究T細(xì)胞功能必不可少的是T細(xì)胞受體(TCR），它們選擇性地結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞 (APC) 表面主要組織相容性復(fù)合體 (MHC) 分子的特定抗原。TCR的抗原識別激活T細(xì)胞，使它們快速增殖并通過釋放細(xì)胞因子產(chǎn)生免疫反應(yīng)。 在眾多的TCR研究方法中，NGS技術(shù)逐漸成了TCR主流的分析方法。但市面上TCR-Seq的方法琳瑯滿目，每種方法之間的細(xì)微差別也會使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果大不同。所以如何選擇合適的方法成為擺在研究人員面前的難題。巴黎索邦大學(xué)的Barennes團(tuán)隊(duì)1評估了市面上9種TCR-Seq方法，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)表在《Nature Biotechnology》雜志上（后文會詳細(xì)闡述）。 |
| TCR-Seq的相關(guān)背景 |
| · 起始材料DNA or RNA？ |
| 大多數(shù)TCR-Seq方法可以根據(jù)起始材料大致分為基于DNA的方法和基于RNA的方法。基于DNA的方法，優(yōu)點(diǎn)是每個(gè)細(xì)胞只有一個(gè)模板，更適合于單個(gè)TCR克隆的定量，但這也可能會導(dǎo)致TCR-Seq成本較高。而基于RNA的方法更加靈敏，能夠定量預(yù)估TCR豐度和基因表達(dá)，并且容易結(jié)合分子標(biāo)簽(UMIs)，減少PCR偏倚，提高對稀有變異的準(zhǔn)確鑒定。 |
| · 建庫策略 |
| 常用的兩種方法是mPCR (多重PCR)和5’RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）。 mPCR支持DNA和RNA起始，通常包括兩輪PCR。第一輪PCR可擴(kuò)增出受體基因座，并添加用于二輪PCR引物位點(diǎn)的已知序列，測序接頭與index隨后整合。然而，第一輪PCR overlap sites的引物位點(diǎn)存在高多樣性，需大量簡并引物，因此易引入PCR bias。而5’RACE技術(shù)只適用RNA作為模板，每輪PCR僅需一對引物，能顯著降低PCR偏差，確保結(jié)果反映樣本的真實(shí)情況。 |
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| 文獻(xiàn)解讀 |
| 選擇 TCR-Seq方法時(shí)需要考慮四個(gè)關(guān)鍵因素：再現(xiàn)性、重復(fù)性、靈敏度和特異性。Barennes團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)地比較9種TCR-Seq方法，包括3個(gè)基于多重PCR以及6個(gè)基于5' RACE-PCR的方法。其中使用相同的細(xì)胞樣本以便盡可能減少由于樣本不同而引起的差異。在本實(shí)驗(yàn)中采用匿名化處理，將5' RACE-PCR方法標(biāo)記為RACE-#，將mPCR方法標(biāo)記為mPCR-#。結(jié)果表明，本次測試的9種方法中，研究人員注意到有3種TCR-Seq方法表現(xiàn)更好：mPCR-1、RACE-3和RACE-5。 |
| 分析不同的TCR-Seq方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性 |
| 研究團(tuán)隊(duì)比較了不同TCR-Seq的重復(fù)性（即不同樣本采用相同方法獲得的數(shù)據(jù)之間的相似性）和再現(xiàn)性（即不同方法獲得的數(shù)據(jù)之間的相似性）。熱圖的結(jié)果表明，RACE-3在TRA和TRB的重復(fù)性和再現(xiàn)性方面均名列前茅，始終都排在前兩名。對于TRA，RACE-5的再現(xiàn)性高于RACE-3，但重復(fù)性低于RACE-3。對于TRB，RACE-3的再現(xiàn)性最好，而mPCR-1的重復(fù)性最好。（注mPCR-1沒有TRA信息，RACE-5沒有TRB信息，但RACE-3同時(shí)提供了TRA和TRB信息。） |
| 分析不同的TCR-Seq方法的靈敏度和特異性 |
| 接下來的測評是針對靈敏度和特異性。在TCR-Seq中，靈敏度是對真正稀有克隆型和變異頻率的準(zhǔn)確量化。 同樣，特異性可以將測序錯(cuò)誤與真正的罕見變異區(qū)進(jìn)行區(qū)分。為了評估每種方法捕獲所有克隆型的能力，研究人員從同一細(xì)胞樣本的108個(gè)重復(fù)（45個(gè)TRA和63個(gè)TRB）中生成了一個(gè)silico meta-repertoire。為了最大程度地減少偏差，采取了以下步驟：將這9種方法獲得的dataset中的所有克隆型合并，去除單例，僅選擇未進(jìn)一步處理（pre-UMI integration）的dataset，并對dataset大小進(jìn)行歸一化處理。采用Meta-repertoire clonotype (MRC)定量方法比較各種方法的靈敏度。 RACE-3生成的dataset包含了多達(dá)50%的TRA和高達(dá)40%的TRB的MRCs，相比之下，其他RACE方法的MRCs為10-20%(文獻(xiàn)中Figure 5, Panel A)。對于TRA，RACE-5也有較高的MRCs。對于TRB，mPCR-1也具有較高的MRCs。就每個(gè)重復(fù)捕獲的MRCs的百分比而言，RACE-3在9個(gè)重復(fù)中捕獲了高達(dá)40%的MRCs，但未能檢測到低于1%的MRCs(文獻(xiàn)中Figure 5, Panel B)。RACE-5和mPCR-1對TRA和TRB的表現(xiàn)與RACE-3相似。對于TRA, RACE-3的9個(gè)重復(fù)中檢測到MRCs的頻率在1%到0.001%之間，其他方法的頻率在1%到0.05%之間(文獻(xiàn)中Figure 5, Panel C, left)，而在任何重復(fù)中未檢測到克隆型的豐度低10到100倍的情況。TRB也有類似的情況。RACE-3和RACE-5表現(xiàn)出更高的靈敏度，因此能檢測到更高比例的低豐度克隆型，尤其是TRA。 |
| 結(jié)論 |
| 在這些TCR-Seq方法中，稀有克隆的多樣性和檢測高度依賴于起始材料的類型和數(shù)量。多重PCR方法更適合檢測克隆型多樣性，但重復(fù)性較低，而5’RACE-PCR則可以更準(zhǔn)確地定量特異性克隆型的豐度。對于后者，作者建議使用基于UMI的方法可以提高準(zhǔn)確性。數(shù)據(jù)指向了三種得分高的方法：mPCR-1是A公司的平臺；RACE-3是Takara Bio 的 SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit；RACE-5是由Eugster2等人開發(fā)的自制方法。 |
| 小編總結(jié)： 雖然Eugster團(tuán)隊(duì)的方法在最終的分析中被認(rèn)為是進(jìn)行TRA分析時(shí)重復(fù)性最佳的方法，但SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit的靈敏度，與Eugster團(tuán)隊(duì)方法以及A公司的平臺具有可比性。SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit可以提供同時(shí)分析TRA和TRB的選項(xiàng)，而且與其他8種方法相比，它在重復(fù)性、可靠性和靈敏度方面始終排名很高。并且SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit在TRA和TRB 的可靠性以及TRB重復(fù)性位列第一。 Takara Bio一直致力于為我們的客戶提供高品質(zhì)、創(chuàng)新的產(chǎn)品。我們改進(jìn)了本研究中使用的TCRv1試劑盒，發(fā)布了新的SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2，其中特別添加UMI和UDI，正如本文作者建議的那樣。 |
| SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2（TCRv2） |
| · 支持10 ng-1 μg外周血淋巴細(xì)胞來源或1 ng-100 ng T細(xì)胞來源的total RNA，以及純化后完整的1,000-10,000個(gè)T細(xì)胞起始； · 添加UMI與UDI建庫，用以校正錯(cuò)誤reads、減少index hopping，結(jié)果更可靠； · 可自由選擇Miseq平臺（分析V(D)J 全長），或是其它Illumina平臺（分析CDR3）； · 流程完整，使用Cogent NGS Immune Profiler Software可完成測序數(shù)據(jù)分析； |
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| 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，添加UMI能將摻入的Jurkat RNA TRBV12-3克隆型的檢測極限下探至0.001%！ |
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| 與同類型產(chǎn)品比較，TCRv2文庫所獲得的克隆型數(shù)量遠(yuǎn)高于Company X RNA法及Company Y DNA法的結(jié)果。（數(shù)據(jù)來源于Takara Bio USA, Inc.） 希望本期分享內(nèi)容，能幫助您選擇到合適的TCR-Seq建庫方案。 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 1. Barennes, P. et al. Benchmarking of T cell receptor repertoire profiling methods reveals large systematic biases. Nature Biotechnology, 1-10 (2020). 2. Eugster, A. et al. Measuring T cell receptor and T cell gene expression diversity in antigen-responsive human CD4+ T cells. Journal of Immunological Methods, 400-401(1), 13–22 (2013). |
| 延伸閱讀：50篇20分↑文章，網(wǎng)友：免疫組庫分析要火？！ |
頁面更新：2021-10-22 10:48:00
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