| Nature：對2500余例血漿樣本進行cfRNA建庫，成功預測疾病發(fā)生的風險 |
| 隨著NGS技術的普及和推廣，很多科研人都已經(jīng)比較了解甚至做過轉錄組建庫測序實驗。但，轉錄組建庫真的簡單嗎？ 很多這樣或者那樣的問題： |
| ·我的樣本是FFPE樣本，但保存時間有點久，質量很差，降解特別嚴重，能建庫嗎？ ·我的樣本是血漿樣本，RNA提取量真的太少了，加上還要去除rRNA，能建庫嗎？ ·我的樣本是游離RNA，做外泌體分析，這種特殊樣本，這能建庫嗎？ ·我的樣本，我的樣本。。。。。。 |
| 想要解決以上問題，首先需要從源頭把控，選擇合適的核酸提取方案以獲得足量RNA用于下游的應用；以及規(guī)范樣本的取樣操作及保存條件，盡量降低RNA降解的風險。 但還是有可能遇到RNA含量低，質量差的問題，該如何應對？ 選擇合適的文庫構建試劑盒來優(yōu)化文庫構建環(huán)節(jié)不失為一種有效地補救措施，一般要關注以下三點： |
| （1）靈敏度：是否支持微量樣本起始，有效檢測基因數(shù) （2）兼容度：是否支持不同品質的RNA樣本，甚至是高度降解的樣本 （3）簡便性：整體流程是否操作時間短，簡便易上手 |
| 上文Nature研究論文中所使用的Takara Bio 的RNA建庫試劑盒SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian（Pico v2）就滿足上述需求，可以針對微量的、質量差的樣本，構建轉錄組文庫的建庫試劑盒。同時，Takara SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian（Pico v3），在Pico v2的基礎上，反轉錄步驟增加8 nt UMI（分子標簽)，因此可以靈敏地識別PCR重復片段、校正PCR擴增錯誤并降低偏好性，從而進行正確的樣本數(shù)據(jù)回溯，提供更可靠的RNA-Seq分析！ |
 |
| ● 可應用于微量樣本 |
| RNA含量低，風險在于可能無法有效構建文庫。這兩個試劑盒可以從以下兩個維度支持微量樣本構建RNA-Seq文庫！ 其一，可以做到皮克級total RNA起始（范圍支持250 pg-10 ng 人、大/小鼠total RNA）構建高品質文庫！，即使珍貴的微量臨床樣本，也無需過于擔心樣本量不足!其二，不用先去除rRNA！雖然在制備文庫前從總RNA中去除核糖體來源的RNA有利于降低測序成本，提高數(shù)據(jù)mapping率。但微量樣品起始時則有可能會造成純化后的樣品太少而不能制備合格的測序文庫。這兩個試劑盒，采用的方法則是先合成cDNA測序文庫，之后特異識別并去除來源于核糖體RNA的cDNA片段。簡單方便的同時，也省去了單獨購買rRNA去除產(chǎn)品的煩惱和費用！ |
 |
| ● 可應用于低品質樣本 |
| RIN值反映的是RNA的完整性，數(shù)值越大表明RNA質量越好，完整性越高。RIN≥8，表明RNA完整性好，無明顯降解。RIN越低則說明RNA降解越嚴重，其構建的文庫風險在于有效數(shù)據(jù)低，mapping率低，duplication高。 這兩個試劑盒均支持分析質量非常差（RIN3-10，DV200≥25%）的FFPE、LCM、以及cfRNA等來源的樣本！以隨機引物起始，捕獲全部mRNA和lncRNA在內(nèi)的信息！ |
| 來看三個實際的應用案例： |
| A. FFPE樣本：FFPE樣本的RNA-Seq分析，能為Biomarker篩查、回顧性研究、疾病機制探討提供可能。然而，由于處理、保存等條件的限制，F(xiàn)FPE樣本中不易留存高品質RNA。同時，提取RNA前不當?shù)那疤幚矸桨?，不合適的擴增方法也不易獲得足夠量的核酸用于NGS分析。 實驗范例：取4個不同降解程度的FFPE-RNA樣本（DV200在28%-68%之間），使用SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian制備文庫，然后進行NGS分析。從數(shù)據(jù)中我們可以看出，①無論RNA起始量高低，或降解是否嚴重，Picov2均能獲得約10,000的轉錄本檢出數(shù)（FPKM≥1），說明Picov2具備足夠高的靈敏度；②同一樣本不同起始量之間數(shù)據(jù)的相關性系數(shù)達到0.99，說明Picov2所制備的文庫具備高度的可重復性 |
 |
| B. cfRNA樣本：存在于人體循環(huán)系統(tǒng)中一些內(nèi)源性或外源性微量RNA片段，包括mRNA、miRNA和lncRNA等。由于在體外易被RNA酶降解，cfRNA完整性常常較低；加之提取的cfRNA常處于微量范疇，為科研工作者NGS分析這類樣本增加難度。 文獻范例：如本文開頭所說，研究團隊對來自8個獨立隊列的1840名孕婦的2539例血漿樣本進行了cfRNA分析，就能在臨床確診幾個月前預測孕期出現(xiàn)先兆子癇的風險。對1908例cfRNA圖譜進行機器學習和建模，并對474例樣本進行測試，其準確性與妊娠中期的超聲檢查相似且優(yōu)于妊娠晚期超聲檢查。在案例中，使用SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian對cfRNA樣本進行文庫構建，并進行了靶向富集測序。由此說明：Pico v2非常適合cfRNA樣本的可靠分析！ 參考文獻：Rasmussen M，Reddy M，Nolan R，et al. RNA profiles reveal signatures of future health and disease in pregnancy[J]. Nature, 2022, 601(7893). |
| C. LCM（激光捕獲顯微切割）樣本：LCM是利用激光在顯微鏡下切割分離出單個細胞或純化單一類型細胞群的一種技術。切割部分可用于進一步的分子生物學方法，如qPCR、NGS、蛋白質組學等。 文獻范例： 研究人員對收集到的1,082份BCa FFPE標本，采用分層隨機化方法分批處理標本。然后通過LCM獲得切片用于后續(xù)實驗。之后篩選出DV200＞15%的樣品用于后續(xù)NGS實驗所用的樣本。使用SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian Kit制備total RNA-Seq文庫，并在Illumina NovaSeq 6000測序（PE 200）,每個樣本獲得約1×109 reads。 參考文獻：Paul ED, et al. Multiplexed RNA-FISH-guided Laser Capture Microdissection RNA Sequencing Improves Breast Cancer Molecular Subtyping, Prognostic Classification, and Predicts Response to Antibody Drug Conjugates. Preprint. medRxiv. 2023; 2023.12.05.23299341. |
| 以上數(shù)據(jù)結果表明：面對不同類型的獲得的微量亦或是低品質樣本，Pico v2和Pico v3都可以勝任文庫構建的任務！ |
| 看到這里，您可能打算買一個試試，但先別著急！ |
| 近期，Takara對產(chǎn)品進行了升級，推出了Takara SMART-Seq® Total RNA Pico Input (ZapR™ Mammalian) 和SMART-Seq® Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR™ Mammalian)，在保留前一代可靠性能的基礎上，有效提升rRNA去除效率，以更好地剔除不需要的reads信息。 （注：這兩個試劑盒分別是Pico v2和Pico v3對應的升級版本，不再包含index） |
| ● 實驗范例：新舊版本的對比實驗 |
| 選擇250 pg的人腦RNA樣本起始，使用SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs制備文庫。之后分別采用ZapR Mammalian rRNA Depletion Kit試劑盒中的模塊處理（+）和未處理（-），然后通過PCR擴增進行富集或者不進行處理。同時，使用前一代版本產(chǎn)品SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian對250 pg的人腦RNA樣本制備文庫。最后使用CogentAP 對3x106PE reads進行數(shù)據(jù)分析。如下圖所示，與前一代版本產(chǎn)品相比，SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian)制備的文庫，rRNA相關reads百分比明顯降低，外顯子reads百分比增加！ |
 |
| ● 實驗范例：構建FFPE樣本高品質文庫 |
| 使用SMART-Seq® Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR™ Mammalian) 制備10 ng FFPE RNA文庫 (RIN=3, DV200=77%)。使用CogentAP進行數(shù)據(jù)分析，使用3x106 PE reads進行數(shù)據(jù)分析。如下圖顯示，即使以降解FFPE樣本起始，可有效去除rRNA來源cDNA，并獲得可靠的測序數(shù)據(jù)結果。 |
 |
頁面更新：2024-12-02 10:37:46
|
使用規(guī)章丨聯(lián)系方式丨 關于個人信息的保護丨特別說明
寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司
Copyright ? 2015 Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. All rights reserved. 京ICP備06030419號-1
京公網(wǎng)安備 110114000405號
