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病原微生物NGS解決方案來了，您準備好項目了嗎？

人類與感染性疾病的戰(zhàn)斗持續(xù)了幾千年。但自17世紀列文虎克第一次用顯微鏡觀察到微生物后，人類才逐漸認知到了感染性疾病是由病原微生物導致，逐步開啟了病原微生物的研究。
主要的研究方法包括經(jīng)典的培養(yǎng)鑒定法、實時熒光定量PCR法、NGS分析、質(zhì)譜分析等多種方法。其中NGS由于可直接從宿主中快速而正確地檢測鑒別病原體的全基因組序列，以及通量高、數(shù)據(jù)庫全等特點，逐漸成為微生物研究領(lǐng)域的重要方法，并為后續(xù)實現(xiàn)對感染性疾病精準診斷、治療及預防提供技術(shù)保障。

NGS在病原微生物研究中的主要應用包括：
(1) 確定病原體全基因組序列，動態(tài)監(jiān)控病原體的基因組變異；
(2) 特殊病原體（少見、未知、混合感染）的快速鑒定；
(3) 病原體的耐藥情況、毒力因子、以及與宿主的相互作用等的研究。

但是，科研人員往往面臨病原微生物核酸含量低、宿主核酸污染、實驗流程復雜等問題，

Takara病原微生物NGS文庫構(gòu)建解決方案，能又快又好地幫您完成以下領(lǐng)域的分析。

1. 病原微生物檢測

宏基因組學（Metagenomics）解決方案

宏基因組學是研究環(huán)境或人體等樣本中所有以DNA為基因組的微生物遺傳物質(zhì)的技術(shù)，它的發(fā)展開啟了病原微生物研究的新時代。這種技術(shù)不依賴微生物分離培養(yǎng)，可直接對臨床樣本中的核酸進行檢測，分析微生物群落、以及微生物與宿主之間的相互關(guān)系。

ThruPLEX DNA-Seq Kit，實現(xiàn)對微量樣品的可靠宏基因組分析

在某些情況下，以非常少量的臨床樣本作為研究對象進行宏基因組分析是難免的，這類樣本包括臨床拭子、體液、少量組織等。ThruPLEX DNA-Seq Kit支持50 pg-50 ng DNA起始，單管操作、手動15 min、總共兩小時，過程中無需轉(zhuǎn)管與純化，輕松應對宏基因組建庫難題！

【文獻案例】

皮膚是人體最大的器官，“網(wǎng)羅”了各種各樣的微生物。多年來，雖然科研人員對涉及皮膚內(nèi)穩(wěn)態(tài)的微生物群落研究有了一些進展，但對皮炎與微生態(tài)失衡之間是否關(guān)聯(lián)知之甚少。近來，瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學院的Dr. Nanna Fyhrquist團隊在Nature Communications雜志上發(fā)表了題為Microbe-host interplay in atopic dermatitis and psoriasis的文章，采用宏基因組學結(jié)合16s rRNA測序、宿主轉(zhuǎn)錄組測序分析技術(shù)，探討過敏性皮炎、銀屑病及健康人皮膚表面微生物群落特征，并與宿主皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析。

結(jié)果顯示，過敏性皮炎與銀屑病皮膚樣品具有各自特有的微生物群落特征，并都與健康人樣本的數(shù)據(jù)存在差異。其中，過敏性皮炎樣本的優(yōu)勢菌為Staphylococcus aureus，與皮膚屏障功能、色氨酸代謝及免疫激活等宿主轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有相關(guān)性；銀屑病樣本顯示出共生的微生物群落結(jié)構(gòu)，并與宿主疾病相關(guān)基因的表達存在弱相關(guān)性。

本案例，作者使用皮膚拭子采集皮膚微生物樣本，采用ThruPLEX DNA-Seq Kit完成宏基因組文庫構(gòu)建，起始DNA量為50-300 pg，非常微量！該試劑盒具有操作簡便，所構(gòu)建文庫覆蓋度均一、多樣性好、duplicates比例低等特點，助力Dr. Nanna團隊獲得了可靠的宏基因組數(shù)據(jù)，為后續(xù)皮膚炎癥biomarker的發(fā)現(xiàn)及靶向治療提供了數(shù)據(jù)支持！

宏轉(zhuǎn)錄組學（Metatranscriptomics）解決方案

自然界并不是所有的微生物都以DNA作為遺傳物質(zhì)，還存在一些以RNA作為遺傳物質(zhì)的病毒。要想分析臨床或環(huán)境樣本中這類微生物的組成及基因組信息，就必須采用宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)。宏轉(zhuǎn)錄組學興起于宏基因組學之后，從RNA水平研究復雜病原微生物群落變化，在進行物種鑒定的同時，還可以關(guān)注各微生物的功能和功能間的相互作用所帶來的的調(diào)控機制。

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian ，助您突破低起始量微生物樣本的宏轉(zhuǎn)錄組項目研發(fā)瓶頸。

在使用鼻拭子、咽拭子、肺泡灌洗液等臨床樣本進行病原微生物NGS分析時，往往會遇到樣本含量少、樣本背景復雜、宿主核酸干擾大、建庫過程PCR擴增不均一等問題，給正確分析病毒基因組信息造成困難。SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian能夠應對這一挑戰(zhàn)。它專為低質(zhì)量樣本設(shè)計，無需進行rRNA前處理操作，可直接以250 pg-10 ng 的total RNA起始，6小時內(nèi)即可制備高質(zhì)量的illumina文庫，已被大量用于RNA病原微生物的檢測分析!

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian

【產(chǎn)品特色】

微量RNA起始 250 pg-10 ng 人、大/小鼠 Total RNA起始

無需擔心RNA降解 兼容不同品質(zhì)的RNA (RIN2-10或DV200>25%）LCM、FFPE來源的樣本以及cfRNA等

操作簡便時間短 不需要前處理rRNA, 6小時內(nèi)完成illumina文庫構(gòu)建

非編碼與編碼同時分析 隨機引物起始，捕獲全轉(zhuǎn)錄組信息

信息可靠 保留鏈特異性信息

Tip：DV200是一種評價RNA質(zhì)量的指標，即長度超過200 nt 的RNA 片段在所有RNA 序列中的比例

【流程概要】

【文獻案例】

復旦大學張永振教授團隊通過測序分析了新冠病毒基因組序列，該病毒基因組來自一名41歲的男性患者，相關(guān)成果發(fā)表在Nature雜志題為A new coronavirus associated with human respiratory disease in China的文章中。本研究對200 μL肺泡灌洗液（BALF）樣本提取總RNA，使用Illumina MiniSeq（PE 150）進行深度宏轉(zhuǎn)錄組測序，確定了該病毒的基因組。同時進行系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)與一組來自于中國蝙蝠SARS樣冠狀病毒基因組相似度達到89.1%。作者使用了SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian制備宏轉(zhuǎn)錄組文庫，通過核心的ZapR v2、Rprobes v2技術(shù)在建庫過程中去除了人源rRNA！

【應用文獻】

Pettersson JH, et al. Meta-transcriptomic identification of hepatitis B virus in cerebrospinal fluid in patients with central nervous system disease.[J]. Diagnostic microbiology and infectious disease, 2019,95(4).

研究人員采用宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)綜合征患者腦脊液中的HBV病毒。使用了SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian構(gòu)建宏轉(zhuǎn)錄組文庫（所用的樣本為150 μl腦脊液，total RNA濃度為50-200 pg/μl）。

2. 病原微生物感染機制的研究

SMART-Seq Single Cell Kit 助力在單細胞水平研究宿主-病原體之間的相互作用關(guān)系！

病毒等病原體入侵人體后，會與宿主細胞表面特異性受體分子結(jié)合進入宿主細胞，并在細胞中完成生命周期。這一過程，會對宿主細胞基因的表達、調(diào)控產(chǎn)生影響。
單細胞水平的研究分析可以幫助科研人員了解在感染病毒時和治療后的宿主基因表達水平的變化，從而幫助研發(fā)合適的治療方法。Takara的SMART-Seq Single Cell Kit可獲得全長轉(zhuǎn)錄本信息，進行細胞類型識別，并可用于亞型變化、SNPs或剪接變異研究，這都將有助于更好地了解感染和治療的反應。

· 1-10個細胞或低至2 pg RNA起始，進行可靠的全長cDNA制備，優(yōu)于許多現(xiàn)有的單細胞全長cDNA合成方法，例如SMART-Seq2！
· 操作簡便，單管完成cDNA制備，避免稀少珍貴的病毒樣本損失！
· 基于SMART技術(shù)，文庫具有出色的轉(zhuǎn)錄本覆蓋度、基因檢出數(shù)！

3. 宿主免疫反應的研究

在成熟的B細胞與T細胞表面存在抗原識別受體蛋白，分別可稱為BCR與TCR。在機體中，為識別各種入侵的抗原及激活免疫反應，BCR與TCR表現(xiàn)出極高的多樣性，這種多樣性主要體現(xiàn)在V(D)J可變區(qū)的重排，及克隆型的構(gòu)成。
因此，想要了解感染病毒時和治療后宿主的免疫系統(tǒng)發(fā)生了什么變化，以下問題需要解答：B細胞或T細胞存在哪些克隆型?克隆型數(shù)量變化了嗎?感染后對這些克隆類型的多樣性有什么影響?在進行治療時，克隆型多樣性是如何變化的?
這些變化，都可以通過NGS技術(shù)來進行分析。

SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit和SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit都基于5’RACE技術(shù)，分別可以快速正確構(gòu)建BCR、TCR文庫用于測序，幫助科研人員正確地進行研究和檢測病毒感染的機體免疫反應。