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| ■ 制品內(nèi)容 (20 次量) |
| Mighty TA-cloning Kit |
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| pMD20-T vector (50 ng/μl) |
20 μl |
| Ligation Mighty Mix*1 |
50 μl × 2 |
| Positive Control Insert*2 |
10 μl |
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| A-overhang mixture |
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| A-overhang enzyme |
10 μl |
| 10 × Buffer |
20 μl |
| dATP |
10 μl |
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*1: Ligation Mighty Mix與DNA Ligation Kit (Code No.: 6023) 是同一種試劑。
*2: 3’端帶有A堿基約200 bp DNA片段。 (以E.coli基因組DNA為模板，使用TaKaRa Ex Taq進(jìn)行PCR反應(yīng)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。)(10 ng/μl) |
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| ■ 制品說(shuō)明 |
使用Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物3’端附有一個(gè)“A” 堿基。利用3’端附有“A” 堿基的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆時(shí)，與含有3’-T末端的載體通過(guò)T-A堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行克隆，此種方法被稱為T-A克隆。Mighty TA-cloning Kit (Code No.: 6028) 是在短時(shí)間內(nèi)快速地將PCR產(chǎn)物進(jìn)行 T-A克隆的試劑盒。連接反應(yīng)使用DNA Ligation Kit，操作簡(jiǎn)便，可在短時(shí)間內(nèi)高效地進(jìn)行連接反應(yīng)。但使用PrimeSTAR系列的α型DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，因酶本身具有很強(qiáng)的3’→5’Exonuclease活性，擴(kuò)增產(chǎn)物幾乎都為平滑末端，不能直接進(jìn)行TA克隆。PrimeSTAR系列DNA聚合酶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆時(shí)，3’端必須添加“A”堿基。
本試劑盒中含有 (A-overhang mixture)，可簡(jiǎn)單地對(duì)PrimeSTAR系列DNA聚合酶的PCR產(chǎn)物3’端添加“A”堿基。A-overhang mixture與MightyTA-cloning Kit 配套使用，是PrimeSTAR系列DNA聚合酶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的TA克隆專用試劑。
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| ■ 保存 |
| -20℃。 |
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| ■ 注意事項(xiàng) |
1. Ligation Mighty Mix在冰上融解，輕輕混合后再使用。
2. 克隆時(shí)，根據(jù)插入片段的長(zhǎng)度和方向，有時(shí)即使插入了DNA片段也會(huì)有不出現(xiàn)終止密碼或讀碼框不改變的情況發(fā)生，在藍(lán)白選擇培養(yǎng)基上會(huì)形成淡藍(lán)色菌落。出現(xiàn)這種現(xiàn)象時(shí)，建議進(jìn)行菌落PCR確認(rèn)插入片段。
3. 進(jìn)行切膠回收純化DNA片段時(shí)要避免UV照射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。長(zhǎng)時(shí)間照射，DNA會(huì)受到損傷，影響克隆效率。
4. 當(dāng)PCR擴(kuò)增用質(zhì)粒模板與克隆載體 (pMD20-T vector；具有Ampr）有同樣的選擇標(biāo)記基因時(shí)，為防止出現(xiàn)質(zhì)粒模板自身的轉(zhuǎn)化菌落，建議切膠回收擴(kuò)增片段后再進(jìn)行克隆。 |
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京公網(wǎng)安備 110114000405號(hào)
增目的片段（灰）.png)
物純化（灰）.png)
縫克隆（灰）.png)
化感受態(tài)細(xì)胞（灰）.png)
