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| ■ 制品內(nèi)容 (20 次量) |
| Mighty TA-cloning Kit |
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| pMD20-T vector (50 ng/μl) |
20 μl |
| Ligation Mighty Mix*1 |
50 μl × 2 |
| Positive Control Insert*2 |
10 μl |
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| A-overhang mixture |
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| A-overhang enzyme |
10 μl |
| 10 × Buffer |
20 μl |
| dATP |
10 μl |
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*1: Ligation Mighty Mix與DNA Ligation Kit (Code No.: 6023) 是同一種試劑。
*2: 3’端帶有A堿基約200 bp DNA片段。 (以E.coli基因組DNA為模板，使用TaKaRa Ex Taq進行PCR反應得到的擴增產(chǎn)物。)(10 ng/μl) |
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| ■ 制品說明 |
使用Taq DNA聚合酶進行PCR反應，擴增獲得的PCR產(chǎn)物3’端附有一個“A” 堿基。利用3’端附有“A” 堿基的PCR產(chǎn)物進行克隆時，與含有3’-T末端的載體通過T-A堿基互補配對原則進行克隆，此種方法被稱為T-A克隆。Mighty TA-cloning Kit (Code No.: 6028) 是在短時間內(nèi)快速地將PCR產(chǎn)物進行 T-A克隆的試劑盒。連接反應使用DNA Ligation Kit，操作簡便，可在短時間內(nèi)高效地進行連接反應。但使用PrimeSTAR系列的α型DNA聚合酶進行PCR反應時，因酶本身具有很強的3’→5’Exonuclease活性，擴增產(chǎn)物幾乎都為平滑末端，不能直接進行TA克隆。PrimeSTAR系列DNA聚合酶的PCR產(chǎn)物進行TA克隆時，3’端必須添加“A”堿基。
本試劑盒中含有 (A-overhang mixture)，可簡單地對PrimeSTAR系列DNA聚合酶的PCR產(chǎn)物3’端添加“A”堿基。A-overhang mixture與MightyTA-cloning Kit 配套使用，是PrimeSTAR系列DNA聚合酶PCR擴增產(chǎn)物的TA克隆專用試劑。
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| ■ 保存 |
| -20℃。 |
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| ■ 注意事項 |
1. Ligation Mighty Mix在冰上融解，輕輕混合后再使用。
2. 克隆時，根據(jù)插入片段的長度和方向，有時即使插入了DNA片段也會有不出現(xiàn)終止密碼或讀碼框不改變的情況發(fā)生，在藍白選擇培養(yǎng)基上會形成淡藍色菌落。出現(xiàn)這種現(xiàn)象時，建議進行菌落PCR確認插入片段。
3. 進行切膠回收純化DNA片段時要避免UV照射時間過長。長時間照射，DNA會受到損傷，影響克隆效率。
4. 當PCR擴增用質(zhì)粒模板與克隆載體 (pMD20-T vector；具有Ampr）有同樣的選擇標記基因時，為防止出現(xiàn)質(zhì)粒模板自身的轉(zhuǎn)化菌落，建議切膠回收擴增片段后再進行克隆。 |
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京公網(wǎng)安備 110114000405號
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