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| ■ 制品內(nèi)容 (50 次量) |
| PrimeScript 1 Step Enzyme Mix |
100 μl |
| 2X 1 Step Buffer (Dye Plus) |
625 μl × 2 |
| Control F-1 Primer (20 μM)*1 |
20 μl |
| Control R-1 Primer (20 μM)*2 |
20 μl |
| Positive Control RNA (2×105 Copies/μl) |
20 μl |
| RNase Free dH2O |
625 μl × 2 |
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| *1 Positive Control RNA用上游引物。 |
| *2 Positive Control RNA用下游引物。 |
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| ■ 制品說明 |
PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種體外擴(kuò)增DNA的簡單而有效的方法。雖然原理上PCR法是擴(kuò)增DNA，RNA不能直接被擴(kuò)增，但是經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄酶的作用把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，PCR法便可應(yīng)用于RNA的解析了。目前，RT-PCR方法已廣泛應(yīng)用于RNA的構(gòu)造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表達(dá)解析等多種領(lǐng)域。
本試劑盒采用了一步（One Step）RT-PCR法。RNA→cDNA→PCR反應(yīng)操作在同一反應(yīng)體系中連續(xù)進(jìn)行，反應(yīng)中途不需添加任何試劑，避免污染危害。同時(shí)反應(yīng)液中已含有電泳時(shí)所必需的色素試劑（藍(lán)色和黃色色素），反應(yīng)后可以直接進(jìn)行電泳。反應(yīng)液為鮮艷的綠色（Emerald Green），電泳時(shí)指示效果明顯，容易觀察樣品的電泳位置。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用了具有很強(qiáng)延伸能力的反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScript RTase。該反轉(zhuǎn)錄酶對具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板也具有很強(qiáng)的延伸能力；PCR反應(yīng)使用了擴(kuò)增性能優(yōu)越的Hot Start型DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS，大大提高了本試劑盒的擴(kuò)增性能和反應(yīng)特異性。反應(yīng)試劑已優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)與不含染料和loading buffer的傳統(tǒng)RT-PCR系統(tǒng)具有相同反應(yīng)效果。在本試劑盒中，已將PrimeScript RTase、TaKaRa Ex Taq HS、RNase Inhibitor以及One Step RT-PCR用穩(wěn)定劑等配制成了Premix型的PrimeScript 1 Step Enzyme Mix；同時(shí)把反應(yīng)用Buffer、dNTP以及One Step Enhancer Solution配制成了Premix型的2×1 Step Buffer（Dye Plus）的形式，使實(shí)驗(yàn)操作時(shí)的反應(yīng)液配制和電泳檢測更為簡單方便。
本試劑盒具有以下特點(diǎn)：
1. 進(jìn)行高效的RT-PCR擴(kuò)增。
2. 反應(yīng)液制備簡單，可直接進(jìn)行凝膠電泳。
3. 反轉(zhuǎn)錄溫度可以設(shè)定為50℃，能夠有效抑制非特異性擴(kuò)增。
4. 可減少由于錯(cuò)配和引物二聚體造成的非特異性反應(yīng)。
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| 本試劑盒中含有進(jìn)行One Step RT-PCR反應(yīng)用的全部試劑，可以方便有效地對RNA進(jìn)行擴(kuò)增分析。 |
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| ■ 各種引物的序列 |
| 引物名稱 |
各引物序列 |
| Control F-1 Primer |
5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ |
| Control R-1 Primer |
5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ |
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| ■ Positive Control RNA |
| 本試劑盒中的Control RNA是以pSPTet3質(zhì)粒 (質(zhì)粒中的SP6啟動(dòng)子下游插入長約1.4 kb的pBR322來源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四環(huán)素基因) 為模板由SP6 RNA聚合酶經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄而得到的。 |
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| 圖1. Positive Control RNA：使用Control Primer可以擴(kuò)增462 bp的DNA片段 |
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| ■ 原理 |
| PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）可在同一反應(yīng)管中連續(xù)進(jìn)行由PrimeScript RTase將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再由TaKaRa Ex Taq HS擴(kuò)增此cDNA的RT-PCR反應(yīng)。 |
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| 圖2. PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus) 原理圖 |
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| ■ 保存 |
| -20℃。 |
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| ■ 試劑盒特點(diǎn) |
| RNA模板 |
適用于所有RNA |
| 擴(kuò)增片段大小 |
～8 kb |
| PrimeScript 1 Step Enzyme Mix |
PrimeScript RTase |
| DNA Polymerase (TaKaRa Ex Taq HS) |
| RNase Inhibitor |
2 × 1 Step Buffer (Dye Plus)
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含有反應(yīng)Buffer
dNTP Mixture (終濃度400 μM)
One Step Enhancer Solution
色素、比重劑
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| 1st strand cDNA合成用引物 |
特異性下游PCR Primer (Oligo-dT Primer和
Random引物不能使用) |
| 操 作 |
在同一反應(yīng)管中連續(xù)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng) |
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| ■ 使用注意 |
| 1. 當(dāng)同時(shí)需要進(jìn)行數(shù)次RT-PCR反應(yīng)時(shí)，應(yīng)先配制各種試劑的混合液，然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中。這樣，可使所取的試劑體積更準(zhǔn)確，減少試劑損失，避免重復(fù)分取同一試劑。同時(shí)也可以減少實(shí)驗(yàn)操作或?qū)嶒?yàn)之間產(chǎn)生的誤差。 |
| 2. 使用PrimeScript 1 Step Enzyme Mix時(shí)，應(yīng)輕輕混勻，避免起泡；分取之前要小心地離心收集到反應(yīng)管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取時(shí)應(yīng)慢慢吸取。 |
| 3. 2 X 1 Step Buffer (Dye Plus) 使用前用Vortex充分混勻，離心后使用。 |
| 4. 酶制品應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前才從-20℃中取出，使用后也應(yīng)立即放回-20℃中保存。 |
| 5. 為了防止Positive Control RNA分解，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。有條件的實(shí)驗(yàn)室最好保存于-70℃～-80℃。 |
| 6. 分裝試劑時(shí)務(wù)必使用新的槍頭，以防止樣品間污染。 |
| 7. 使用本試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)必須使用特異性的反轉(zhuǎn)錄引物，Random Primer、Oligo dT Primer不能使用。 |
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