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| 聚焦T細胞治療研究，如何獲得更高的基因?qū)胄剩?/strong> | |||||||||||||||||||
| 腫瘤一直都困擾著人類健康，腫瘤治療研究也是數(shù)年來的科學難題。使用轉(zhuǎn)基因T細胞（T淋巴細胞）來靶向治療腫瘤是一種很有前景的方法，特別是對于難以使用傳統(tǒng)方法來治療的腫瘤。 |
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| 2020年12月17日，CAR-T療法Tecartus在歐盟獲得了有條件上市許可，在這之前這款CAR-T療法已獲得FDA加速批準上市。這是繼2017年CAR-T療法Kymriah和Yescarta 獲得FDA批準上市后的全球第三款CAR-T療法，為復(fù)發(fā)或難治性套細胞淋巴瘤（R/R MCL）成人患者帶來了曙光。到目前為止，在我國國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心藥物臨床試驗登記與信息公示平臺上登記的T細胞治療藥物已超過20種，其中大部分為CAR-T細胞治療。 | |||||||||||||||||||
| 在T細胞治療中最為常見的兩種方法圍繞著在基因工程T細胞中引入新的T細胞受體（TCR）或嵌合抗原受體（CAR）（Humphries 2013）來開展。過繼性T細胞療法的工作流程主要包括以下幾大步：從病人體內(nèi)分離T細胞，在體外對這些T細胞進行基因改造，然后將改造后的T細胞回輸至病人體內(nèi)。除了這種被稱作自體同源的方法之外，全世界的一些公司正致力于開發(fā)一種可以從單一供體生產(chǎn)，然后用于治療數(shù)千名患者（異體同源方法）的治療方法。在這兩種方法中，T細胞改造都是在患者體外進行的（體外基因治療）。 | |||||||||||||||||||
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| 為了將TCR/CAR基因有效地引入T淋巴細胞中，構(gòu)建高質(zhì)量的TCR-T或者CAR-T細胞，高效的基因?qū)胄十斎皇侵陵P(guān)重要的。那么，問題來了，如何才能獲得更高更穩(wěn)定的基因?qū)胄誓兀?/strong> | |||||||||||||||||||
| 那我們就要從基因?qū)肫脚_來說起了。眾所周知，慢病毒載體是目前過繼性T細胞治療研究中所使用的主要基因?qū)肫脚_。慢病毒載體一般是以HIV - 1 （Human immunodeficiency virus 1型）為基礎(chǔ)開發(fā)的，可用于絕大多數(shù)哺乳動物細胞基因?qū)?，包括像造血干細胞及神?jīng)細胞等在內(nèi)的非分裂細胞，而這些是使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體難以實現(xiàn)的。 | |||||||||||||||||||
| 出于安全性考慮，通常將表達病毒包裝蛋白質(zhì)的基因分別承載在不同的質(zhì)粒上，以防止在包裝過程中這些編碼序列會全部被包裝到病毒粒子中。包裝質(zhì)粒和慢病毒表達載體之間缺乏同源序列，這也阻止了通過同源重組來轉(zhuǎn)移這些基因。這種基因分裂、反式表達策略有效地防止了具有復(fù)制能力的慢病毒的產(chǎn)生，比如，病毒不能在靶細胞中自主復(fù)制。 | |||||||||||||||||||
| 所以，要想獲得重組慢病毒載體，就需要將目標基因克隆至一個慢病毒質(zhì)粒骨架中，這個質(zhì)粒骨架包含病毒功能所需要的順式作用元件。將構(gòu)建好的慢病毒載體與包裝質(zhì)?；旌显谝黄?，借助轉(zhuǎn)染試劑（脂質(zhì)體或者聚合物轉(zhuǎn)染試劑）轉(zhuǎn)染病毒包裝細胞系，通常為基于293T的細胞。包裝質(zhì)粒在包裝細胞中表達制備病毒粒子所需要的所有病毒蛋白質(zhì)，從而制備產(chǎn)生重組慢病毒，并將病毒粒子釋放在培養(yǎng)液上清中。 | |||||||||||||||||||
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| 高病毒滴度無疑是獲得高基因?qū)胄实拈_端。 | |||||||||||||||||||
| 就包裝系統(tǒng)而言，目前市面上主要是第三代和第四代慢病毒包裝系統(tǒng)。在眾多不同品牌的包裝系統(tǒng)中，我們的Lenti-X Packaging Single Shots第四代慢病毒包裝系統(tǒng)很有技術(shù)亮點。 | |||||||||||||||||||
| 這款包裝系統(tǒng)使用的是5個獨立組件組成的包裝系統(tǒng)，并且5個組件按照特定的優(yōu)化比例混合，提高了病毒包裝性能。在這個包裝系統(tǒng)中，gag，pol和env基因被分離開來，可以進一步降低RCL（復(fù)制型慢病毒）產(chǎn)生的概率。事實上，有文獻報道使用這種方法并沒有檢測到RCL的出現(xiàn)（Wu et al., 2000）。這些改進顯著提高了這款包裝系統(tǒng)的生物安全性。在病毒滴度方面，Tet-Off和Tat反式激活因子驅(qū)動病毒必需成分高水平表達，誘導(dǎo)級聯(lián)表達反應(yīng)，從而可以制備出高滴度慢病毒，VSV-G型包裝系統(tǒng)病毒滴度可達到107-108 IFU/ml。另外，pol基因與vpr基因的融合可以確保反轉(zhuǎn)錄酶/整合酶蛋白質(zhì)能夠轉(zhuǎn)運到重組慢病毒顆粒中。而在第三代慢病毒包裝系統(tǒng)中，通常gag和pol序列是不分離的，也沒有使用反式激活級聯(lián)機制。 | |||||||||||||||||||
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| 為了方便使用，這款包裝系統(tǒng)打破了傳統(tǒng)形式，采用了預(yù)混的凍干粉形式。將慢病毒包裝質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑預(yù)混后進行預(yù)分裝和凍干處理，所以不再額外需要轉(zhuǎn)染試劑了。對于研究人員來說，操作非常簡便，一管一個反應(yīng)，只需要一步操作流程：那就是只需加入目標基因表達質(zhì)粒。這種包裝形式還可以在很大程度上降低操作誤差，確保不同樣品和批次間的一致性。除了常規(guī)的使用10厘米培養(yǎng)皿進行病毒包裝的規(guī)格之外，96孔板的規(guī)格更適用于小規(guī)模包裝的高通量應(yīng)用。 | |||||||||||||||||||
| 合適且穩(wěn)定的病毒滴度是慢病毒成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因素。 | |||||||||||||||||||
| 成功制備出重組慢病毒后，了解所制備病毒液中的病毒粒子數(shù)或者感染單位，無疑是很重要的，因為它在很大程度上決定了靶細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率（也就是有多少病毒進入同一個細胞），從而決定了轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細胞中整合的基因拷貝數(shù)。 | |||||||||||||||||||
| 包裝產(chǎn)生的重組慢病毒粒子會被釋放在培養(yǎng)液上清中，包含完整的具有感染性的病毒粒子、不具有感染性的病毒粒子（包括不成熟或者空病毒粒子）和游離的衣殼蛋白（也就是p24）。常見的滴度測定方法有兩種：一種為物理測定方法，通過測量相應(yīng)的核酸或蛋白質(zhì)的量來確定病毒粒子濃度；另一種為功能測定方法，計數(shù)能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的病毒粒子數(shù)（IFU/ml）。物理滴度測定方法通常使用qRT-PCR和p24-ELISAs，這些方法相對簡單，但無法區(qū)分功能性和非功能性病毒粒子（直接和/或間接分析釋放到上清液中的病毒成分來測定）。相比之下，功能滴定方法專門量化能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細胞的病毒粒子（即感染單位或IFU），但這些方法耗時更長、更費力。 | |||||||||||||||||||
| 那這是不是就意味著，想要掌握功能性病毒粒子數(shù)，我們就必須使用功能滴度測定方法呢？ | |||||||||||||||||||
| 病毒滴度測定的一個關(guān)鍵方面是，當制備病毒粒子的方法（受包裝系統(tǒng)、純化/過濾、濃縮/沉淀、收集病毒時間等因素影響）保持一致時，使用物理或功能測定方法測量的滴度比率是保持不變的。所以，值得慶幸的是，雖然物理測定方法可能無法直接量化功能性病毒粒子，但一旦建立了物理滴度測定方法和功能滴度測定方法之間的關(guān)系，那么物理滴度測定就將是一種快速、可靠的可替代功能滴度測定的方法。但需要注意的是，想要使用物理測定方法定量比較兩種病毒制劑，所有的制備和制備后處理步驟必須使用相同的試劑，以相同的方法來進行。 | |||||||||||||||||||
| 說到這里，作為技術(shù)控的小編，將向大家隆重介紹三種慢病毒滴度測定方案（提前劇透，使用智能手機測定病毒滴度，黑科技呀）。 | |||||||||||||||||||
| Lenti-X p24 Rapid Titer Kit基于ELISA方法而開發(fā)，特異性檢測衣殼蛋白質(zhì)p24快速測定慢病毒滴度。通過與p24標準品(試劑盒中提供)制作的標準曲線相比較，可以得出樣品中p24的含量，從而計算出檢測樣品的病毒滴度。這是目前廣受歡迎的慢病毒滴度測定方法。Lenti-X qRT-PCR Titration Kit基于qRT-PCR方法而開發(fā)，通過檢測病毒基因組快速測定慢病毒滴度。將樣品和標準品RNA (試劑盒中提供) 進行梯度稀釋，然后分別進行qRT-PCR反應(yīng)后繪制曲線。通過與標準曲線的Ct值比較，就可以獲得樣品所包含的病毒基因組拷貝數(shù)。這兩種測定方案都可以在4小時內(nèi)快速完成，縮短了病毒收獲和感染靶細胞的時間間隔，可在一天內(nèi)完成收獲病毒和感染靶細胞的實驗過程。 | |||||||||||||||||||
| 除了以上兩種方案之外，Lenti-X GoStix Plus是一種更快速更智能化的測定方案。使用這種測定方法，能夠以智能手機作為數(shù)據(jù)讀取和分析工具以智能手機作為數(shù)據(jù)讀取和分析工具，在十分鐘之內(nèi)定量測定重組慢病毒滴度，而不需要購買檢測儀器。Lenti-X GoStix Plus基于側(cè)向?qū)游鰴z測技術(shù)開發(fā)，可以快速檢測慢病毒上清液中的p24蛋白質(zhì)，通過測定慢病毒上清液中p24衣殼蛋白質(zhì)的含量來確定慢病毒滴度。Lenti-X GoStix Plus檢測框中Test指示條帶的出現(xiàn)，說明樣本中含有足夠用量的慢病毒粒子，然后使用智能手機上的免費應(yīng)用程序GoStix Plus app量化慢病毒滴度。使用這種檢測方法，不需要自行建立標準曲線，而且每次檢測只需要20 μl上清液作為檢測樣品，節(jié)約樣品用量。 | |||||||||||||||||||
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| 如果慢病毒滴度低，不足以確保高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，怎么辦？Takara還可以提供一款無需超速離心操作的濃縮試劑Lenti-X Concentrator，可簡單、快速且高效地濃縮慢病毒上清液的試劑，濃縮倍數(shù)可高達100倍，回收率高達90%。整個操作流程非常簡單，濃縮規(guī)模可按照需求擴大或者縮小。 | |||||||||||||||||||
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| 實現(xiàn)高基因?qū)胄剩叩腡細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率至關(guān)重要。 | |||||||||||||||||||
| 在過繼性T細胞療法中，為了有效地將TCR / CAR基因引入T淋巴細胞中，高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是至關(guān)重要的。然而，典型的低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和T細胞擴增速率一直都是一個大難題。此處，小編必須安利一款RetroNectin GMP級試劑，它不僅可以用于增強病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，還對幼稚T細胞群有擴增作用，而且與常用的轉(zhuǎn)導(dǎo)增強劑（比如聚凝胺和魚精蛋白）相比，對細胞的毒性更低。在經(jīng)RetroNectin 包被的培養(yǎng)容器表面，細胞與慢病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒以高濃度共存，可以將轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提高30%-70%。另外RetroNectin 還可以刺激淋巴細胞，使其獲得上千倍的增殖。 | |||||||||||||||||||
| Takara已向美國FDA提交了RetroNectin GMP級試劑的藥品主文件（DMF application number 18898），并且擁有RetroNectin技術(shù)的全球獨家使用權(quán)。該產(chǎn)品已在全球44個機構(gòu)中用于超過68種基因治療臨床試驗方案。美國國立衛(wèi)生研究院Steven Rosenberg博士研究組、紀念斯隆凱特琳癌癥中心、日本三重大學醫(yī)院在進行相關(guān)疾病臨床研究過程中，都使用了RetroNectin GMP級試劑進行了T細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，眾多其它臨床研究使用文章也已發(fā)表，點擊此處了解更多。 | |||||||||||||||||||
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| 除了慢病毒載體外，CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)作為一種非病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式，在T細胞治療研究中也展現(xiàn)出巨大潛力。使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，可以對T細胞基因組進行敲入修飾，成功構(gòu)建CAR-T細胞。然而如何高效導(dǎo)入是一個非常大的挑戰(zhàn)，也就是說通過什么樣的方式可以把Cas9核酸酶和單向?qū)NA（sgRNA）有效、安全而且盡可能低副作用地運送到目標細胞中，這是一個難題。多項研究結(jié)果表明，通過電穿孔方法直接將Cas9-gRNA核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物導(dǎo)入至T細胞中可以實現(xiàn)有效基因編輯，降低脫靶效應(yīng)。當然除了電穿孔方法之外，RNP也可以通過顯微注射或者轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入至靶細胞。Takara可以提供常規(guī)研究級別和GMP級別的無標簽重組Cas9蛋白質(zhì)。這款GMP級別的重組Cas9蛋白質(zhì)，不含人源或動物源成分，它的溶液成分經(jīng)過了優(yōu)化，對哺乳動物細胞具有良好的耐受性，可降低導(dǎo)入哺乳動物細胞時所造成的細胞損傷。 | |||||||||||||||||||
| 有了這些新技術(shù)新工具，您還擔心獲得不了更高更穩(wěn)定的基因?qū)胄蕟?？希望有了新技術(shù)新工具的加持，腫瘤治療研究可以有進一步的突破，讓更多人類無力抗爭的腫瘤疾病從無望治療變成有望治愈。 | |||||||||||||||||||
| 當然，助力T細胞治療研究的寶藏技術(shù)還有很多，比如調(diào)取TCR/scFv的SMARTer RACE技術(shù)，癌癥患者接受免疫治療前后T細胞受體NGS分析技術(shù)，等等。然而篇幅有限，小編也只能介紹這么多了。正所謂，工欲善其事，必先利其器。想要了解更多T細胞治療研究工具，點擊鏈接跳轉(zhuǎn)T細胞治療研究解決方案，開啟您的寶藏之旅吧。 | |||||||||||||||||||
| References | |||||||||||||||||||
| Wu, X. et al. Development of a novel trans-lentiviral vector that affords predictable safety. Mol. Ther. 2, 47–55 (2000). | |||||||||||||||||||
頁面更新：2020-12-31 13:14:34
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