| 酵母雜交--植物抗逆性研究好工具 |
| 眾所周知，植物需要應(yīng)對持續(xù)變化的環(huán)境,包括經(jīng)常性的不利于植物生長和發(fā)育的脅迫環(huán)境。這些不良環(huán)境包括生物脅迫(如病原體感染)和非生物脅迫(例如干旱、高溫、冷害、營養(yǎng)匱乏、鹽害以及土壤中鋁、砷、鎘等有毒金屬毒害)，不僅影響農(nóng)作物品質(zhì)，還對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生十分不利的影響，植物如何感受和響應(yīng)逆境脅迫是一個根本性的生物學(xué)問題。因此，開展逆境脅迫的基礎(chǔ)研究、提高植物抗逆性顯得尤為重要。 酵母雜交作為研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA之間相互作用的方法，因為其廣譜適應(yīng)性、真實性、實驗操作簡單、成本相對較低、通量大等特點也逐漸成為植物研究的重要工具，被廣泛應(yīng)用于植物如何感受和響應(yīng)逆境脅迫的研究中。 |
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| 生物脅迫-棉花對尖孢鐮刀菌的免疫反應(yīng) |
| 棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌引起的、發(fā)生在棉花的病害，是棉花生產(chǎn)中危害最嚴重的病害之一，曾被稱為棉花的“癌癥”之一。對這種脅迫的適應(yīng)涉及到復(fù)雜的感知、信號和脅迫反應(yīng)機制。植物絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 級聯(lián)在介導(dǎo)植物生物和非生物脅迫的反應(yīng)中起重要作用，并且是細胞外刺激作為信號在細胞內(nèi)被轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑。其中GhMKK6-GhMPK4級聯(lián)信號通路在棉花免疫中起重要作用。分析GhMKK6-GhMPK4級聯(lián)信號通路在棉花抗枯萎病中的作用和調(diào)控機制顯得尤為重要。 為了分析被尖孢鐮刀菌攻擊的棉花的免疫反應(yīng)，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)王琛課題組使用病毒誘導(dǎo)的基因沉默 (VIGS) 技術(shù)對GhMKK6下游的GhMPK4的功能進行分析，結(jié)果表明沉默GhMPK4會降低棉花對枯萎病的耐受性，并降低某些抗性基因的表達。GhMPK4與GhMKK6的過度表達都會導(dǎo)致不利的棉花免疫反應(yīng)特性。綜上，GhMPK4可能與SA通路介導(dǎo)的防御途徑有關(guān)，因此可能在棉花防御真菌中起重要作用。 為了進一步研究植物在進化過程中的反饋調(diào)控機制。以GhMPK4作為誘餌蛋白質(zhì)，利用Takara Matchmaker® Gold酵母雙雜交系統(tǒng)（Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System 630489)行酵母雙雜交篩選，在棉花中篩選并鑒定了MAPK激酶蛋白磷酸酶AP2C1的負調(diào)節(jié)因子。通過對AP2C1的一系列功能分析發(fā)現(xiàn)，GhAP2C1與GhMPK4相互作用調(diào)節(jié)棉花對尖孢鐮刀菌的免疫反應(yīng)。以上結(jié)果，為功能分析和研究MAPK級聯(lián)的反饋調(diào)節(jié)機制提供了重要數(shù)據(jù)，有助于闡明MAPK級聯(lián)作用的調(diào)節(jié)機制以應(yīng)對病原體。 |
| 非生物脅迫-水稻的磷酸鹽饑餓反應(yīng) |
| 磷是植物生長和發(fā)育所必需的常量營養(yǎng)素，磷缺乏限制了全球30%耕地的作物產(chǎn)量。闡明植物中的磷信號通路將為提高作物磷利用效率和優(yōu)化肥料施用提供信息。為了適應(yīng)低磷環(huán)境，植物進化出復(fù)雜的調(diào)控機制，盡管近年來植物對缺磷反應(yīng)的分子機制取得了很大進展，但植物響應(yīng)和適應(yīng)磷酸鹽缺乏的分子機制尚不清楚。 為了探明該機制，浙江大學(xué)毛傳澡課題組使用Takara Matchmaker® Gold酵母雙雜交系統(tǒng)（Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System 630489) 篩選與磷酸鹽反應(yīng)抑制因子OsSPX4（SPX4）具有相互作用的蛋白，獲得了11個候選蛋白（25 個陽性菌落），包括OsbHLH6（8 個菌落）、OsPHR2 同源物和7種其他蛋白質(zhì)。OsbHLH6（bHLH6）是一種編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白的未表征的磷饑餓反應(yīng)基因。其中bHLH6和SPX4之間的相互作用通過酵母雙雜交技術(shù)（Y2H）測定得到證實。為了確定bHLH6的哪個結(jié)構(gòu)域與SPX4相互作用，作者檢測了SPX4與不同蛋白片段的bHLH6之間的相互作用。只有全長bHLH6與SPX4強烈相互作用。運用免疫共沉淀（Co-IP）及雙分子熒光互補 (BiFC) 測定方法對SPX4與bHLH6在體內(nèi)的相互作用進行檢測，最終確定SPX4與bHLH6在體外和體內(nèi)均有相互作用。 之后作者通過時空轉(zhuǎn)錄組、RT-qPCR、Pull down等研究分析得出結(jié)論，在磷缺乏的情況下，bHLH6的表達在芽中顯著被誘導(dǎo)。bHLH6過表達系顯示出磷積累和增強的磷饑餓反應(yīng)，包括磷饑餓誘導(dǎo)（PSI）基因的上調(diào)和更長的根毛。bHLH6突變體在苗期沒有表現(xiàn)出顯著的表型變異。與OsPHR2相比，bHLH6與SPX4的結(jié)合親和力更高，因此，bHLH6競爭性地抑制了SPX4和OsPHR2的相互作用。SPX4過表達挽救了在高磷和低磷條件下由 bHLH6過表達引起的磷積累。此外，在 SPX4背景中bHLH6的過表達不影響在高磷和低磷條件下SPX4的磷含量。bHLH6/SPX4雙突變體在高磷條件下與SPX4突變體相比，表現(xiàn)出較低的莖磷濃度和OsPT3和OsPT10的轉(zhuǎn)錄本豐度。RNA測序結(jié)果表明bHLH6 OV和SPX4共享許多差異表達的磷反應(yīng)基因。因此，bHLH6是拮抗SPX4的磷信號傳導(dǎo)和穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子。以上結(jié)果給闡明植物適應(yīng)缺磷的分子調(diào)控提供了有力幫助，并將促進對低磷耐受性作物的培育。 |
| 酵母雙雜交系統(tǒng)最初是由Fields等利用釀酒酵母GAL4轉(zhuǎn)錄因子的特性建立的，該研究成果被發(fā)表在《Nature》上。轉(zhuǎn)錄因子GAL4由兩個可分離且功能必需的結(jié)構(gòu)域組成：一個與特定DNA序列（UASG）結(jié)合的N端結(jié)構(gòu)域；另一個是激活轉(zhuǎn)錄所必需的C末端結(jié)構(gòu)域，基于此特性，F(xiàn)ields生成了一個包含GAL4的兩種混合蛋白的系統(tǒng)：與蛋白質(zhì)“X”融合的GAL4 DNA結(jié)合域和與蛋白質(zhì)“Y”融合的GAL4激活區(qū)。如果X和Y可以形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物并重建GAL4結(jié)構(gòu)域的鄰近性，則會發(fā)生由UASG調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。使用兩種已知有相互作用的酵母蛋白——SNF1和SNF4對該系統(tǒng)進行測試，結(jié)果只有當兩個融合蛋白都存在于細胞中時，才能獲得高轉(zhuǎn)錄活性。由此得出，酵母雜交系統(tǒng)可通過使用半乳糖（報告基因）選擇來識別與已知蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)。 |
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| 目前，酵母雙雜交實驗采用的系統(tǒng)有LexA系統(tǒng)和GAL4系統(tǒng)兩種。在LexA系統(tǒng)中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由一個完整的原核蛋白LexA構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域由一個來自大腸桿菌的88個氨基酸殘基組成的B42蛋白構(gòu)成，它在酵母中可以活化基因的轉(zhuǎn)錄。 相較于LexA系統(tǒng)，GAL4系統(tǒng)的使用更加廣泛，其中比較有代表性的當屬Takara酵母雜交產(chǎn)品線--Matchmaker®系列產(chǎn)品（包括Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System、Make Your Own Mate & Plate Library System、Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2等眾多產(chǎn)品），提供文庫構(gòu)建、大規(guī)模篩選和鑒別驗證一站式解決方案，自問世以來，助力無數(shù)專家學(xué)者成功進行蛋白質(zhì)互作研究，因其產(chǎn)品線完整、產(chǎn)品種類豐富、假陽性低，篩選高效，操作簡單等特點，受到各個領(lǐng)域?qū)W者的歡迎！ Takara Matchmaker®系列產(chǎn)品廣受歡迎，好評不斷，三大亮點搶先看。 首先，提供多種組織特異的均一化Mate & Plate™通用文庫，均一化處理降低了cDNA文庫中高豐度轉(zhuǎn)錄本所占的比例，篩選的克隆數(shù)更少，并且可以確保篩選到包含中等豐富和低等豐度轉(zhuǎn)錄本的克隆。您可以花費較少的精力篩選到更多的獨立克隆，并有更大的機會檢測到重要的互作，更加省時省力。其中，均一化的擬南芥文庫（Mate & Plate™ Library - Universal Arabidopsis (Normalized) 630487）尤其受到各位植物研究學(xué)者的歡迎，擬南芥作為模式植物，被廣泛應(yīng)用于植物生理學(xué)、分子生物學(xué)等多個研究領(lǐng)域。而該文庫由從擬南芥11個組織中分離的mRNA構(gòu)建而成，等量混合并轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y187中，提供完整的表達基因覆蓋，可以直接用于雙雜交篩選實驗。 如果Mate & Plate™中沒有適合您需要的文庫，您可使用 酵母雙雜交文庫構(gòu)建系統(tǒng)（Make Your Own Mate & Plate Library System 630490）自己制作文庫，利用SMART cDNA合成技術(shù)，使用任意組織來源的低至100 ng的總RNA，即可構(gòu)建cDNA文庫。一周之內(nèi)即可構(gòu)建足夠用于數(shù)百次酵母雙雜交篩選實驗所需要的文庫。文庫構(gòu)建是在Y187文庫酵母菌株中通過酵母高效的同源重組機制直接完成的，無需傳統(tǒng)文庫構(gòu)建過程中的一些繁冗的操作 (比如文庫克隆、擴增和大腸桿菌收集等)，操作更簡單，性價比更高。 |
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| 除此之外，您還可以委托Takara進行cDNA文庫及酵母單雙雜交服務(wù)，服務(wù)種類多樣，包括構(gòu)建均一化、非均一化酵母單雜交、雙雜交文庫；單框、三框酵母文庫；物種不限、部位不限，所有真核生物都可構(gòu)建！ 其次，酵母雙雜交系統(tǒng)（Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System 630489），可以用于體內(nèi)大規(guī)模的初步篩選蛋白質(zhì)相互作用候選目標，采用4個報告基因/3個不同bait識別序列的雙雜交系統(tǒng)，由于任何prey蛋白單獨結(jié)合引起假陽性都需要識別3個不同序列，激活4個報告基因的表達，有效地降低了假陽性。同時，報告基因中新型的、穩(wěn)定的酵母雙雜交抗生素AbA（630466），可以有效殺死非抗性克隆，從而大大降低了背景克隆的生長。 最后，對于蛋白質(zhì)互作結(jié)果驗證，除去使用酵母雙雜交系統(tǒng)（630489）反向驗證外，您還可以選擇免疫共沉淀方法進行驗證，IP和Co-IP是研究蛋白質(zhì)與大分子（例如其他蛋白質(zhì)）之間相互作用的很有意義的實驗手段。Capturem™ IP & Co-IP Kit（635721）應(yīng)用于IP和Co-IP實驗，Takara特別的Capturem技術(shù)，實現(xiàn)了基于膜上的蛋白質(zhì)捕獲，從而使得免疫共沉淀純化部分的操作時間從傳統(tǒng)的數(shù)個小時縮減到5分鐘左右，使實驗效率顯著提高。 不僅如此，Takara還提供適用于酵母雙雜交系統(tǒng)、文庫構(gòu)建系統(tǒng)等的培養(yǎng)基及酵母質(zhì)粒提取、酵母轉(zhuǎn)化等各類輔助試劑，滿足多種實驗需求。 Takara用心做產(chǎn)品，不辜負您的每一次期待，提供酵母雜交一站式解決方案，讓您的酵母雜交實驗更簡單方便！ |
| 參考文獻： Fields, S., & Song, O. (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 340(6230), 245 246. Guo, D., Hao, C., et al. (2022). The Protein Phosphatase GhAP2C1 Interacts Together with GhMPK4 to Synergistically Regulate the Immune Response to Fusarium oxysporum in Cotton. International journal of molecular sciences, 23(4), 2014. He, Q., Lu, H., et al. (2021). OsbHLH6 interacts with OsSPX4 and regulates the phosphate starvation response in rice. The Plant journal: for cell and molecular biology, 105(3), 649 667. Nishimura, M. T., & Dangl, J. L. (2010). Arabidopsis and the plant immune system. The Plant Journal, 61(6), 1053-1066. Oh, C. S., & Martin, G. B. (2011). Effector-triggered immunity mediated by the Pto kinase. Trends in plant science, 16(3), 132 140. Raghothama K. G. (1999). Phosphate Acquisition. Annual review of plant physiology and plant molecular biology, 50, 665 693. Zhu J. K. (2016). Abiotic Stress Signaling and Responses in Plants. Cell, 167(2), 313–324. |
頁面更新：2022-11-16 08:47:51
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