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當(dāng)前位置:首頁(yè) > AAV基因治療研究應(yīng)用 > 重組腺相關(guān)病毒(AAV)制品

無(wú)標(biāo)題文檔

 
AAV基因治療罕見遺傳病潛力巨大,臨床研究顯示療效積極
 
基因治療將使醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)生革命,為治療常見和罕見遺傳性疾病帶來(lái)了新希望。在基因治療這場(chǎng)競(jìng)技賽中,腺相關(guān)病毒(AAV)載體已經(jīng)迅速成為體內(nèi)基因?qū)胫饕脚_(tái)之一(Goswami et al. 2019)1

由于AAV載體免疫原性和細(xì)胞毒性低,能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞,并且整合到宿主基因組中的頻率非常低,因此被眾多研究學(xué)者認(rèn)為安全性更高。經(jīng)過重組和改造的AAV載體擁有不同的血清型,根據(jù)血清型不同而具有不同的宿主范圍和病毒特征,可以有效作用于特定細(xì)胞類型,包括分裂和非分裂細(xì)胞類型。使用者需要根據(jù)靶標(biāo)細(xì)胞或者組織類型選擇適合的血清型。目前使用頻率較高的血清型為AAV2,其它血清型也逐漸被廣泛使用。

迄今為止,已有兩種AAV基因療法被FDA批準(zhǔn)。第一種為L(zhǎng)uxturna,于2017年獲得批準(zhǔn)用于治療萊伯氏先天性黑蒙癥,這是一種遺傳性視網(wǎng)膜疾病。第二種為Zolgensma,于2019年獲得批準(zhǔn)用于治療小兒脊髓性肌萎縮癥。除了以上這兩種獲得批準(zhǔn)的治療方法外,其他幾種AAV療法已經(jīng)或者正在世界范圍內(nèi)開展臨床試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。重組AAV載體的安全性和有效性已在多個(gè)Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)。

由于血腦屏障(BBB)的存在,治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是非常具有挑戰(zhàn)性的。研究發(fā)現(xiàn),許多AAV載體,尤其是AAV1、AAV2、AAV5、AAV8和AAV9,對(duì)神經(jīng)元的轉(zhuǎn)導(dǎo)是非常有用的2。因此,許多AAV介導(dǎo)的治療方法已經(jīng)或者正在試驗(yàn)中,以治療溶酶體儲(chǔ)存障礙、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、癲癇、1型脊髓性肌萎縮癥、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、芳香族L-氨基酸脫羧酶(AADC)缺乏癥和巴頓?。℅oswami et al. 2019)1

其中芳香族L-氨基酸脫羧酶(AADC)缺乏癥是一種罕見的神經(jīng)肌肉疾病,由于DDC基因突變所引起。AADC缺乏癥的主要病癥是運(yùn)動(dòng)障礙,包括自主運(yùn)動(dòng)喪失、張力減退、間歇性眼病危象(OGC)和肢體肌張力障礙。AADC缺乏癥表現(xiàn)在嬰兒早期,嚴(yán)重情況下會(huì)使患者終生臥床不起。目前AADC缺乏癥還沒有特別好的治療辦法,藥物治療只對(duì)中度或輕度表型患者有輕微效果,但對(duì)大多數(shù)重癥患者療效甚微。

截止到2020年11月,Clinical Trials. Gov上登記數(shù)據(jù)顯示,開展AADC缺乏癥臨床試驗(yàn)的項(xiàng)目為4項(xiàng),目前正處于I期或者II期臨床試驗(yàn)階段,這些研究均使用AAV2作為體內(nèi)基因?qū)肫脚_(tái)。除此之外,2019年自治醫(yī)科大學(xué)Kojima et al.發(fā)表了一項(xiàng)I期和II期試驗(yàn)結(jié)果3,該試驗(yàn)旨在研究AAV療法對(duì)4-19歲、DDC基因突變患者的影響。作者以AAV為介導(dǎo)導(dǎo)入DDC基因,通過雙側(cè)肺輸注的方式給藥,將表達(dá)人DDC基因的臨床級(jí)AAV載體(由Takara Bio Japan提供AAV載體包裝制備服務(wù))作用于6例患者,其中5例是臥床不起的患者。輸注后,作者監(jiān)測(cè)了患者的運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知和語(yǔ)言功能,同時(shí)也監(jiān)測(cè)了由AAV載體引起的任何不良反應(yīng)。作者發(fā)現(xiàn),6名患者的運(yùn)動(dòng)功能都得到了改善,阿爾伯塔嬰兒運(yùn)動(dòng)量表(AIMS)分?jǐn)?shù)的增加可以證明這一點(diǎn)。在進(jìn)行基因治療之前, 患者1、4、5和6的AIMS得分為0,患者2的得分為1,患者3的得分為52。接受治療之后,所有患者的得分均得到改善。接受治療12個(gè)月時(shí),患者3的得分達(dá)到了58,是所有患者的最高得分。治療后,一名臥床不起的患者在助行器協(xié)助下能夠下床行走,另外兩名患者能夠在有所支撐的情況下站立。與AADC缺乏癥相關(guān)的其他病癥在所有患者中均有所改善,包括肌張力障礙、多涎、呼吸困難和情緒障礙。在治療過程中沒有觀察到嚴(yán)重的不良反應(yīng),這表明這種AAV介導(dǎo)的基因治療對(duì)AADC缺乏癥患者來(lái)說,可能是一種安全有效的治療方法。這項(xiàng)研究證明了AAV載體在治療像AADC缺乏癥這樣的罕見遺傳疾病方面是有潛力的。

作為體內(nèi)基因?qū)胫饕脚_(tái)之一,AAV已經(jīng)在多個(gè)疾病治療臨床試驗(yàn)中顯現(xiàn)出有明顯的治療效果,而且不會(huì)引起顯著的不良免疫反應(yīng)。比如在REP1基因突變導(dǎo)致的無(wú)脈絡(luò)膜癥、CNGB3基因突變導(dǎo)致的色盲或者全色盲、線粒體DNA點(diǎn)突變和ATP生成障礙所引起遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)這些遺傳性眼科疾病方面,研究結(jié)果顯示接受AAV基因治療后患者視力有所提高4,5,6。AAV也是一種廣泛應(yīng)用于癌癥基因治療的病毒載體。多種AAV載體已被用于腫瘤治療,眾多臨床前研究結(jié)果顯示,AAV基因治療成功抑制腫瘤生長(zhǎng),致使腫瘤消退。另外,AAV還廣泛應(yīng)用于血液病、代謝類等疾病的治療研究,展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。

Takara Bio作為先進(jìn)的生物技術(shù)企業(yè),從基礎(chǔ)研究到新藥開發(fā)等領(lǐng)域,我們都可以向生物技術(shù)研究和產(chǎn)業(yè)支援提供支持。在AAV基因治療研究領(lǐng)域,Takara Bio具有完善的AAV產(chǎn)品解決方案——從表達(dá)、包裝、提取到純化和滴度測(cè)定,一站式配齊您的AAV載體研究裝備。
 
 
 ◆ 無(wú)輔助病毒AAV載體制備系統(tǒng)
 
AAV Helper Free System是一種特別的可制備高滴度AAV的無(wú)輔助病毒系統(tǒng),可提供AAV 1型 (AAV1) 、2型 (AAV2) 、5型 (AAV5) 、6型 (AAV6) 制備系統(tǒng)。我們?cè)谠撓到y(tǒng)的包裝載體中引入了一種可提高病毒滴度的人源miRNA(hsa-miR-342),與一般只表達(dá)Rep基因和Cap基因的pRC2 Vector相比,病毒滴度可提高2倍。由于AAV是一種微小病毒,可克隆的目的基因片段大小限制在不超過2.5 kb。>>了解詳情
 
 
 
 ◆ 強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合的AAV-CRISPR系統(tǒng)
 
AAV與CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合使用,可以通過AAV載體導(dǎo)入CRISPR/Cas9進(jìn)行基因治療,可以讓更多無(wú)望治療的疾病變成有望治愈,將基因治療推向了一個(gè)新高度。在AAV-CRISPR 系統(tǒng)方面,可以提供釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)兩種不同來(lái)源Cas9的系統(tǒng)。攜帶釀膿鏈球菌來(lái)源的Cas9(SpCas9)的AAV-CRISPR系統(tǒng),是一個(gè)雙載體系統(tǒng),利用了AAV自身的同源重組特性,在不影響病毒正常制備的情況下,可以將長(zhǎng)度約為4.1 kb SpCas9基因?qū)胫涟屑?xì)胞。攜帶金黃色葡萄球菌來(lái)源的Cas9(SaCas9)的AAV-CRISPR系統(tǒng),是一個(gè)單載體系統(tǒng),使用相對(duì)簡(jiǎn)便。不過需要注意的是,與SpCas9不同,SaCas9所識(shí)別的PAM序列為NNGRR(T),N表示任意堿基,R表示A或者G,T具有較強(qiáng)的偏好性。>>了解詳情
 
 
 ◆ 擴(kuò)大AAV載體產(chǎn)量必備單品
 
AAV2傾向于保留在制備細(xì)胞中(由于肝素結(jié)合域的原因),可以使用專用的提取試劑AAVpro Extraction Solution從制備細(xì)胞中提取并回收病毒粒子。而其他血清型AAV,更容易釋放到培養(yǎng)液中,因此從培養(yǎng)液中分離AAV可以有效擴(kuò)大AAV載體產(chǎn)量。AAVpro Concentrator就是可以從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離濃縮任何血清型AAV載體這樣一種簡(jiǎn)便高效的方法。
 
與僅涉及AAV顆粒沉淀的其他濃縮方法相比,AAVpro Concentrator操作過程中包含了過濾步驟,可以產(chǎn)生更高純度的AAV載體。而混合-離心的操作流程適用于各種起始量,易于擴(kuò)展?jié)饪s規(guī)模,并且手動(dòng)操作時(shí)間不到一個(gè)小時(shí)。整個(gè)操作過程沒有超速離心步驟,使用普通離心機(jī)就可完成。我們使用AAVpro Concentrator將40 ml培養(yǎng)液上清濃縮至200 μl,病毒滴度可提高95倍,回收率大約為48%。我們通常通過生物學(xué)分析方法來(lái)檢測(cè)所制備的AAV載體的感染性滴度,使用AAV載體感染允許細(xì)胞(permissive cell)并測(cè)定轉(zhuǎn)基因表達(dá)量,確定轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TUs)。以MOIs為5,000或500的濃縮后AAV載體感染靶細(xì)胞,其感染效率分別為44.7%或9.2%。>>了解詳情
 
 
 ◆ 通用簡(jiǎn)便的AAV載體純化方式
 
AAV載體作為體內(nèi)基因?qū)氲闹饕脚_(tái)之一,使用高純度的病毒粒子是很有必要的,需要去除源自病毒包裝細(xì)胞和培養(yǎng)基的雜質(zhì)。即便是將基因?qū)胫僚囵B(yǎng)細(xì)胞時(shí),使用純化后的AAV粒子也可以消除雜質(zhì)所帶來(lái)的影響。AAV粒子的純化通常使用CsCl密度梯度超速離心法或碘克沙醇超速離心法,但這兩種方法不僅需要熟練的操作手法,同時(shí)還存在耗時(shí)長(zhǎng)和回收率低等問題。
 
Takara通用型AAVpro Purification Kit不受血清型限制,可以從AAV粒子制備細(xì)胞中純化出AAV粒子,并且可以在4個(gè)小時(shí)內(nèi)操作完成。本試劑盒使用了特別的AAV粒子提取方法,省去了凍融和超聲破碎等繁瑣操作;特別的AAV載體純化方法,通過簡(jiǎn)單的操作即可有效去除雜質(zhì)。我們可提供兩種不同純化規(guī)格,方便從不同細(xì)胞數(shù)量中純化病毒粒子。>>了解詳情
 
 
 ◆ 通用快速的AAV滴度測(cè)定方法
 
基于qPCR技術(shù)開發(fā)了通過測(cè)定AAV基因組來(lái)測(cè)定AAV滴度的試劑盒,同以往的DNA印跡法和ELISA法相比,可以更準(zhǔn)確、更快速地(2.5小時(shí)以內(nèi))獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。AAVpro Titration Kit(for Real Time PCR)Ver.2試劑盒中的引物特異針對(duì)AAV載體的公共區(qū)域AAV2反向末端重復(fù)序列(ITR)而設(shè)計(jì),如果載體的ITR區(qū)域來(lái)自AAV2(實(shí)際上常用的AAV載體也正是這樣的情況),那么無(wú)論您制備出的AAV病毒是哪種血清型(取決于病毒包裝時(shí)所使用的Cap基因),都可以使用這個(gè)試劑盒測(cè)定病毒滴度。下圖所示檢測(cè)結(jié)果表明,對(duì)于每個(gè)血清型(AAV1、AAV2、AAV6),通過實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增CMV區(qū)域或者ITR區(qū)域所測(cè)定的病毒滴度大致相同。如果您不確定該試劑盒是否適用于您的載體,請(qǐng)與我們的技術(shù)服務(wù)部門聯(lián)系,并提供您的載體序列。>>了解詳情
 
 
References

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2. Hocquemiller M, Giersch L, Audrain M, Parker S, Cartier N. Adenoassociated virus-based gene therapy for CNS diseases. Hum Gene Ther. (2016) 27:478–96. doi: 10.1089/hum.2016.087
3. Kojima, K. et al., Gene therapy improves motor and mental function of aromatic L-amino acid decarboxylase deficiency. Brain 42, 322–333 (2019).
4. Edwards TL, Jolly JK, Groppe M, Barnard AR, Cottriall CL, Tolmachova T, et al. Visual Acuity after Retinal Gene Therapy for Choroideremia. N Engl J Med. (2016) 374:1996–8. doi: 10.1056/NEJMc1509501
5. Sengillo JD, Justus S, Cabral T, Tsang SH. Correction of monogenic and common retinal disorders with gene therapy. Genes (Basel). (2017) 8:E53. doi: 10.3390/genes8020053
6. Feuer WJ, Schiffman JC, Davis JL, Porciatti V, Gonzalez P, Koilkonda RD, et al. Gene therapy for leber hereditary optic neuropathy: initial results. Ophthalmology. (2016) 123:558–70. doi: 10.1016/j.ophtha.2015.10.025