重組腺相關(guān)病毒基因編輯系統(tǒng)（AAV2）
AAVpro® CRISPR/Cas9 Helper Free System (AAV2) |
· 以病毒傳遞的方式導(dǎo)入Cas9基因和sgRNA，可以實現(xiàn)在難轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞中進行基因編輯，包括分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞
· AAV病毒導(dǎo)入Cas9基因可以排除基因組整合和Cas9基因持續(xù)表達所帶來的影響，降低脫靶效應(yīng)
· 包裝輔助質(zhì)粒表達人microRNA miR-342有助于顯著提高AAV病毒滴度
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| ■ 產(chǎn)品說明： |
我們可以提供兩種CRISPR/Cas9 AAV2病毒粒子制備系統(tǒng)，無需輔助病毒，可采用Cas9進行基因編輯：AAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free System和AAVpro CRISPR/SaCas9 Helper Free System。這兩個試劑盒都可以用于將Cas9表達框和一個用戶自定義的單向?qū)NA (sgRNA)導(dǎo)入至哺乳動物細(xì)胞中。Cas9基因序列來源于釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）或者金黃色釀膿葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。AAV系統(tǒng)可用于廣泛哺乳動物細(xì)胞類型，有效實現(xiàn)體外基因組修飾。CRISPR/Cas9系統(tǒng)采用兩個AAV載體導(dǎo)入較大的S. pyogenes Cas9 (SpCas9)，而由于SaCas9相對較小，CRISPR/SaCas9系統(tǒng)可以借助單個載體實現(xiàn)導(dǎo)入。sgRNAs可被直接一步克隆至預(yù)線性化的pAAV-Guide-it-Down或者pAAV-Guide-it-1質(zhì)粒。無需輔助病毒，只需與試劑盒所包含的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞即可制備高滴度的AAV2病毒粒子。AAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free System (Code No. 632608) 和AAVpro CRISPR/SaCas9 Helper Free System (Code No. 632619) 都是完整試劑盒，包含了sgRNAs克隆和AAV病毒粒子制備所需要的所有試劑。同樣也包含了有效分離提取AAV2病毒粒子的AAV Extraction Solution。需要注意的是，SpCas9和SaCas9即使作用于基因組的同一區(qū)域，其靶向效率也是不同的–詳細(xì)信息請見實驗例。
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| AAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free Systems (with S. pyogenes Cas9) |
· SpCas9基因被分成兩段分別承載在pAAV-Guide-it-Up和pAAV-Guide-it-Down兩個質(zhì)粒上，兩段SpCas9基因之間有1.6-kb的區(qū)域是同源的，同源區(qū)域在靶細(xì)胞中通過同源重組形成全長SpCas9基因
· SpCas9使用的前間區(qū)序列鄰近基序(Protospacer Adjacent Motif,PAM)序列為NGG，其中N代表任意堿基-詳細(xì)信息請見AAVpro CRISPR/Cas9 Systems使用手冊
· 所提供的pAAV-Guide-it-Down質(zhì)粒是預(yù)線性化的，有利于一步克隆sgRNAs，降低由于質(zhì)粒自連所產(chǎn)生的背景
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| AAVpro CRISPR/SaCas9 Helper Free Systems (with S. aureus Cas9) |
· SaCas9基因組裝在單個質(zhì)粒pAAV-Guide-it-1上，同時也包含了sgRNA表達框
· SaCas9 (來自于金黃色釀膿葡萄球菌)使用的前間區(qū)序列鄰近基序(Protospacer Adjacent Motif,PAM) 序列為NNGRR(T)，其中N代表任意堿基，R代表A或者G堿基，(T)具有較強的偏好性-詳細(xì)信息請見AAVpro CRISPR SaCas9 Systems使用手冊
· 所提供的pAAV-Guide-it-1質(zhì)粒是預(yù)線性化的，有利于一步克隆sgRNAs，降低由于質(zhì)粒自連所產(chǎn)生的背景
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圖1. 全長Cas9和sgRNA產(chǎn)生。
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pAAV-Guide-it-Up和pAAV-Guide-it-Down載體分別編碼被刪減的Cas9基因上游和下游部分，兩者之間有1.6-kb同源重疊區(qū)域。將一個用戶自定義的單向?qū)NA (sgRNA)克隆至pAAV-Guide-it-Down（見載體圖譜）。pAAV-Guide-it-Up或者pAAV-Guide-it-Down與pRC2-mi342和pHelper載體共同轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞制備AAV2-Up或者AAV2-Down病毒。采用AAV Extraction Solution分離提取制備產(chǎn)生的病毒粒子。AAV2-Up和AAV2-Down病毒共轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。AAV基因組處理過程中會在1.6-kb同源重疊區(qū)域發(fā)生同源重組，形成全長Cas9基因，轉(zhuǎn)錄并翻譯成Cas9蛋白質(zhì)。
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| 圖2. AAV載體重組產(chǎn)生全長Cas9和sgRNA。 |
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Cas9基因較大導(dǎo)致不能將其包裝至單個AAV病毒粒子中。pAAV-Guide-it-Up和pAAV-Guide-it-Down載體分別包含Cas9經(jīng)過刪減的上游和下游部分，這兩部分之間具備1.6-kb同源重疊區(qū)域。采用兩個質(zhì)粒分別進行病毒包裝制備病毒。制備完成的病毒共同轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞，通過同源重組形成全長Cas9基因（4.1 kb）。在靶細(xì)胞中表達的功能Cas9蛋白質(zhì)由sgRNA導(dǎo)向至合適的基因型位點。
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| 圖3. pAAV-Guide-it-Up載體圖譜。 |
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這是pAAV-Guide-it-Up載體的結(jié)構(gòu)。這個載體包含在AAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free System中，此系統(tǒng)用于制備AAV病毒粒子實現(xiàn)Cas9和sgRNA基因的細(xì)胞導(dǎo)入，這兩者是進行CRISPR/Cas9基因編輯所必需的組分。由于Cas9基因較大，使得其不能包裝在單個AAV病毒粒子中。為了可以實現(xiàn)AAV介導(dǎo)的Cas9基因的導(dǎo)入，此系統(tǒng)采用了兩個單獨的Cas9質(zhì)粒。pAAV-Guide-it-Up載體包含一段被刪減的Cas9基因上游部分（3,106 bp），由CMV啟動子驅(qū)動編碼Cas9 N端1,035個氨基酸。
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| 圖4. pAAV-Guide-it-Down載體圖譜。 |
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這是預(yù)線性化的pAAV-Guide-iT-Down載體的結(jié)構(gòu)。這個載體包含在AAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free system中，此系統(tǒng)用于制備AAV病毒粒子實現(xiàn)Cas9和sgRNA基因的細(xì)胞導(dǎo)入，這兩者是進行CRISPR/Cas9基因編輯所必需的組分。由于Cas9基因較大，使得其不能包裝在單個AAV病毒粒子中。為了可以實現(xiàn)AAV介導(dǎo)的Cas9基因的導(dǎo)入，此系統(tǒng)采用了兩個單獨的Cas9質(zhì)粒。pAAV-Guide-it-Down載體包含了一段被刪減的Cas9基因下游部分（2,616 bp），編碼Cas9 C端872個氨基酸。一個用戶自定義的單向?qū)NA (sgRNA)可被克隆至pAAV-Guide-it-Down載體中，位于人U6啟動子的下游。要構(gòu)建這個載體，需要先將作用于基因組靶位點的一對寡核苷酸鏈（向?qū)蛄校┩嘶鹦纬呻p鏈，然后將形成的雙鏈DNA克隆至預(yù)線性化的載體中。
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| 圖5. HEK 293T細(xì)胞制備的AAV2-Up和AAV2-Down 病毒粒子的基因組滴度相同。 |
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采用AAVpro Extraction Solution從HEK 293T細(xì)胞中分離提取AAV2-Up和AAV2-Down病毒粒子（參考protocol overview）。采用AAVpro Titration Kit (for Real Time PCR)檢測基因組滴度。3次平行實驗的結(jié)果表明所獲得的AAV2-Up和AAV2-Down基因組滴度相近。
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| 圖6. 與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，尤其針對難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，AAVpro CRISPR/Cas9系統(tǒng)會產(chǎn)生更多的基因突變。 |
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轉(zhuǎn)導(dǎo)前1天將所標(biāo)注的細(xì)胞類型(1.0 x 105 cells)接種至12孔板中。作用于CCR5 基因的AAV2-Up和AAV2-Down病毒粒子以1.0 x 105 MOI（基因組滴度）轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。72小時后，收集細(xì)胞并采用Guide-it Mutation Detection Kit進行分析。作為對照，采用Xfect Transfection Reagent轉(zhuǎn)染編碼Cas9和靶向CCR5基因的向?qū)蛄械馁|(zhì)粒(P: 2.5 μg)至靶細(xì)胞。
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| 圖7. AAVpro CRISPR/SaCas9系統(tǒng)通過單個載體表達SaCas9和sgRNA。 |
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pAAV-Guide-it-1以預(yù)線性化形式提供，用于插入sgRNA靶序列（橘色標(biāo)注部分為sgRNA）。采用此載體包裝獲得的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞時，靶細(xì)胞會同時表達進行基因編輯的SaCas9和sgRNA。
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| 圖8. Guide-it Mutation Detection Kit平行比較采用AAVpro CRISPR/Cas9 System (SpCas9)和AAVpro CRISPR/SaCas9 System產(chǎn)生的基因組修飾。 |
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以CYP2外顯子1兩個不同的基因組區(qū)域為靶位點，孔1和2顯示每個酶的檢測結(jié)果，凝膠圖下面的圖顯示靶區(qū)域。每個細(xì)胞類型的突變百分比標(biāo)注在每個孔下面。轉(zhuǎn)導(dǎo)前1天將3種不同細(xì)胞系分別接種1 x 105個細(xì)胞至12孔板。采用兩載體系統(tǒng)AAVpro CRISPR/Cas9 System (SpCas9)或者單載體系統(tǒng)AAVpro CRISPR/SaCas9 System制備的病毒粒子以1.0 x 105 MOI（基因組滴度）轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。72小時后，收集細(xì)胞并采用Guide-it Mutation Detection Kit進行分析
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| ■ 產(chǎn)品組份 |
| AAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free System (AAV2)（Code No. 632608） |
1. AAVpro CRISPR/Cas9 Vector Set
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| pAAV-Guide-it-Up Vector |
500 ng/μl |
| pAAV-Guide-it-Down Vector（Linear） |
7.5 ng/μl |
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2. Guide-it Ligation Components
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| DNA Ligation Mighty Mix |
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| Guide-it Oligo Annealing Buffer |
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| Guide-it Control Annealed Oligos |
100 fmol/μl |
| Guide-it Sequencing Primer 1 |
100 pmol/μl |
| PCR-Grade Water |
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3. Stellar Competent Cells（Code No. 636763）
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4. pRC2-mi342 Vector（1 μg/μl）
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5. pHelper Vector（1 μg/μl）
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6. AAVpro Extraction Solution
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| AAV Extraction Solution A |
1.5 ml×3 |
| AAV Extraction Solution B |
150 μl×3 |
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| AAVpro CRISPR/Cas9 Vector System（Code No. 632609） |
1. AAVpro CRISPR/Cas9 Vector Set
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| 20 μl pAAV-Guide-it-Up Vector |
500 ng/μl |
| 20 μl pAAV-Guide-it-Down Vector（Linear） |
7.5 ng/μl |
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2. Guide-it Ligation Components
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| DNA Ligation Mighty Mix |
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| Guide-it Oligo Annealing Buffer |
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| Guide-it Control Annealed Oligos |
100 fmol/μl |
| Guide-it Sequencing Primer 1 |
100 pmol/μl |
| PCR-Grade Water |
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3. Stellar Competent Cells（Code No. 636763）
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| AAVpro CRISPR/SaCas9 Helper Free System (AAV2)（Code No. 632619） |
| 1. pAAV-Guide-it-1 Vector (Linear) （7.5 ng/μl） |
20 μl |
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2. Guide-it Ligation Components v3
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| DNA Ligation Mighty Mix |
50 μl |
| Guide-it Oligo Annealing Buffer |
1.5 ml |
| Guide-it Control Annealed Oligos v3 (100 fmol/μl) |
10 μl |
| Guide-it Sequencing Primer 1 (100 pmol/μl) |
10 μl |
| PCR Grade Water |
1 ml |
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3. Stellar Competent Cells（Code No. 636763）
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| 4. pRC2-mi342 Vector（1 μg/μl） |
20 μl |
| 5. pHelper Vector（1 μg/μl） |
20 μl |
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6. AAVpro Extraction Solution
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| AAV Extraction Solution A |
1.5 ml×3 |
| AAV Extraction Solution B |
150 μl×3 |
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| AAVpro CRISPR/SaCas9 Vector System（Code No. 632618） |
| 1. pAAV-Guide-it-1 Vector (Linear) （7.5 ng/μl） |
20 μl |
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2. Guide-it Ligation Components v3
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| DNA Ligation Mighty Mix |
50 μl |
| Guide-it Oligo Annealing Buffer |
1.5 ml |
| Guide-it Control Annealed Oligos v3 (100 fmol/μl) |
10 μl |
| Guide-it Sequencing Primer 1 (100 pmol/μl) |
10 μl |
| PCR Grade Water |
1 ml |
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3. Stellar Competent Cells（Code No. 636763）
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| ■ 保存 |
Stellar Competent Cells：－80℃
其它：－20℃
（AAVpro Extraction Solution溶解后置于室溫保存）
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京公網(wǎng)安備 110114000405號
胞基因型確認(rèn)（灰）.png)
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計工具（灰）.png)
入方法（黃）.png)
