| 基因編輯后基因敲入檢測(cè) | ||||||
| 品牌 | Code No. | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 包裝量 | 價(jià)格（元） | 說(shuō)明書(shū) | 數(shù)量 |
| Clontech | 632659 | Guide-it™ Knockin Screening Kit | 100 Rxns | ￥5,041 |
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| Clontech | 632660 | Guide-it™ Knockin Screening Kit | 400 Rxns | ￥12,725 |
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| 基因編輯后基因敲入檢測(cè)試劑盒，簡(jiǎn)便·快速 Guide-it Knockin Screening Kit |
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| Guide-it Knockin Screening Kit可高靈敏度地檢測(cè)通過(guò)同源重組（homologous recombination, HR）所產(chǎn)生的基因編輯位點(diǎn)，可用于檢測(cè)使用CRISPR/Cas9等技術(shù)進(jìn)行基因編輯的批量或者單克隆細(xì)胞。該試劑盒采用了簡(jiǎn)單的基于熒光的檢測(cè)方法，不論所敲入的插入物長(zhǎng)度（從單堿基替換到更長(zhǎng)的插入片段）或被編輯的基因組區(qū)域序列如何，都可以對(duì)由同源重組（HR）所產(chǎn)生的基因組編輯位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，這種檢測(cè)方法簡(jiǎn)便可靠。 |
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| 該試劑盒操作流程簡(jiǎn)便快速，主要包括基因組靶標(biāo)位點(diǎn)PCR擴(kuò)增，綠色和紅色雙色熒光檢測(cè)的酶法測(cè)定。這個(gè)酶法測(cè)定實(shí)驗(yàn)，使用熒光讀板機(jī)或定量PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)即可進(jìn)行測(cè)定，不需要其他特殊儀器。整個(gè)操作流程大約需要4個(gè)小時(shí)，由于熒光信號(hào)的檢測(cè)與基因組靶標(biāo)位點(diǎn)上目標(biāo)序列的正確引入是正相關(guān)的關(guān)系，從而確?？梢詸z測(cè)到突變。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 在引入單核苷酸多態(tài)性（SNP）的應(yīng)用中，該檢測(cè)方法能夠在混合和克隆細(xì)胞群中高靈敏度地檢測(cè)出單核苷酸替換，可鑒定識(shí)別含有兩個(gè)不同等位基因的雜合克?。ɡ鐢y帶經(jīng)編輯（SNP）和未經(jīng)編輯（WT）各一個(gè)拷貝的等位基因）。對(duì)于敲入更長(zhǎng)基因序列的應(yīng)用，使用這種檢測(cè)方法可以在插入序列的5'和3'末端，同時(shí)檢測(cè)是否無(wú)縫插入。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ 特點(diǎn) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| · 無(wú)需測(cè)序，快速確定是否發(fā)生了正確的基因敲入 · 可用于批量或者單克隆細(xì)胞檢測(cè) · 操作簡(jiǎn)單快速，4小時(shí)可完成檢測(cè) · 無(wú)需特殊儀器，使用熒光讀板機(jī)或者定量PCR儀進(jìn)行測(cè)定 · SNP分析理想選擇，雙色檢測(cè)可同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)不同等位基因（SNP和WT等） |
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| ■ 應(yīng)用 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| · 在經(jīng)過(guò)編輯的細(xì)胞群中快速檢測(cè)單核苷酸替換或準(zhǔn)確敲入 · 在雜合克隆中同時(shí)檢測(cè)已編輯和未編輯的等位基因 · 在進(jìn)行單細(xì)胞克隆之前對(duì)雜合的細(xì)胞群進(jìn)行編輯效率分析 |
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| ■ 在線工具 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 寡核苷酸DNA設(shè)計(jì)對(duì)于使用Guide-it Knockin Screening Kit進(jìn)行SNP分析是非常必要的，這個(gè)在線工具可以讓您輕松設(shè)計(jì)每個(gè)寡核苷酸DNA。 |
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| 注意：此在線工具僅用于設(shè)計(jì)檢測(cè)單堿基替換的寡核苷酸DNA，而不能用于檢測(cè)長(zhǎng)片段插入的寡核苷酸DNA的設(shè)計(jì)。 |
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| Oligo design tool for Guide-it SNP screening assays |
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| ■ Tech Note | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 在iPSC中引入與疾病相關(guān)的遺傳變異，包括SNP，可以評(píng)估這些變異在相關(guān)細(xì)胞類(lèi)型中的表型效應(yīng)，并消除由于遺傳背景引起的變異性，從而可以更精細(xì)地分析疾病機(jī)制并更快速地評(píng)估潛在療法 （例如，藥物篩選）。Guide-it Knockin Screening Kit提供了一種簡(jiǎn)便快速的方法，可以在繁瑣耗時(shí)的單細(xì)胞克隆分離之前，從大量編輯后的細(xì)胞群和最終產(chǎn)生的克隆細(xì)胞群中，明確鑒定出成功的同源重組修復(fù)(homology-directed repair, HDR)。 |
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| 詳情點(diǎn)擊圖片查看 |
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| ■ 使用實(shí)例 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 圖1. 使用Guide-it Knockin Screening Kit檢測(cè)敲入的插入片段全長(zhǎng) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 基因編輯后，通過(guò)FACS或有限稀釋法分離的大量細(xì)胞群和克隆細(xì)胞系可能表現(xiàn)出多種模式，例如野生型（WT），引入插入/缺失（indel）或敲入了全長(zhǎng)插入片段。從克隆細(xì)胞中提取DNA并擴(kuò)增靶標(biāo)位點(diǎn)，然后將PCR產(chǎn)物與兩套不同的displacement oligo（紫色）和flap probe進(jìn)行雜交：一個(gè)與插入片段的5'端雜交（Flap-probe oligo A; 綠色），另外一個(gè)與3'端雜交（Flap-probe oligo B; 橙色）。如果同源重組成功并且全長(zhǎng)插入片段無(wú)縫正確插入的情況下，探針會(huì)與兩端完全雜交，Guide-it Flapase剪切flap probes后產(chǎn)生綠色和紅色熒光信號(hào)。當(dāng)僅檢測(cè)到一種熒光信號(hào)（紅色或綠色）時(shí)，表明插入片段分別在5'端或3'端發(fā)生了缺失。如果沒(méi)有檢測(cè)到熒光，則表明靶標(biāo)位點(diǎn)依然是野生型序列或者引入了indel。 |
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| 圖2. 引入單堿基替換的常見(jiàn)結(jié)果 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 展示了使用基因編輯技術(shù)進(jìn)行單堿基替換（G＞T）的示例，此工作流程示例為G>A替換檢測(cè)示例。 |
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| Panel A. 在基因組靶標(biāo)位點(diǎn)的結(jié)果：當(dāng)在靶標(biāo)位點(diǎn)沒(méi)有發(fā)生成功切割，或者成功切割后發(fā)生了基于非同源末端連接(NHEJ)的準(zhǔn)確修復(fù)的情況下，靶標(biāo)位點(diǎn)沒(méi)有發(fā)生變化，結(jié)果仍然為野生型(WT)序列。當(dāng)切割后發(fā)生了基于NHEJ的不準(zhǔn)確修復(fù)的情況下，其結(jié)果是在靶標(biāo)位點(diǎn)引入了插入或缺失（Indel），這可能會(huì)導(dǎo)致基因敲除（KO；極有可能的結(jié)果）。當(dāng)切割后發(fā)生了準(zhǔn)確的HDR時(shí)，則會(huì)在靶標(biāo)位點(diǎn)引入SNP。 Panel B. 二倍體細(xì)胞中等位基因組合結(jié)果：在二倍體細(xì)胞中進(jìn)行編輯時(shí)，每個(gè)等位基因的編輯結(jié)果可能會(huì)有所不同，從而產(chǎn)生多種可能的組合。如果沒(méi)有發(fā)生基因編輯，細(xì)胞仍然可以保持純合型（野生型；頂部）；如果發(fā)生了不準(zhǔn)確的NHEJ修復(fù)，會(huì)有一個(gè)或兩個(gè)等位基因被修飾（Indel；中間）；如果發(fā)生了成功的HDR，則可以獲得一個(gè)或兩個(gè)等位基因中引入了目標(biāo)SNP的細(xì)胞（成功的HDR；底部）。 |
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| 圖3. 使用Guide-it Knockin Screening Kit進(jìn)行SNP分析的流程 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 此示例工作流程演示了對(duì)G>A單堿基替換的分析，其中G是野生型堿基，被編輯為A。在基因編輯后，將單細(xì)胞擴(kuò)培成為克隆細(xì)胞系，目標(biāo)基因的靶標(biāo)位點(diǎn)可能具有幾種不同的基因型結(jié)果。擴(kuò)增靶位點(diǎn)后，將PCR產(chǎn)物與不同的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交：displacement oligo（紫色）與flap-probe oligo A（綠色；編碼SNP等位基因，A）或flap-probe oligo B（橙色；編碼WT等位基因，G）組合使用。寡核苷酸退火至PCR產(chǎn)物后，Guide-it Flapase酶（剪刀所示）識(shí)別完全的堿基配對(duì)，并切割flap-probe oligo 5’端部分（綠色或橙色陰影）。切割下來(lái)的flaps由相對(duì)應(yīng)的Guide-it flap detectors檢測(cè)，并分別產(chǎn)生綠色或紅色熒光信號(hào)。在上面的示例中，在靶標(biāo)位點(diǎn)僅產(chǎn)生紅色信號(hào)的克隆細(xì)胞系分析是純合WT（G/G），而同時(shí)產(chǎn)生紅色和綠色信號(hào)的則是攜帶已編輯和WT等位基因（G/A）的雜合克隆。 |
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| 圖4. 檢測(cè)iPS細(xì)胞群中PSEN1位點(diǎn)的準(zhǔn)確堿基替換 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 為了驗(yàn)證Guide-it Knockin Screening Kit的SNP檢測(cè)功能，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了編碼PSEN1基因突變體A>G替換（M164V）的雜合型iPS細(xì)胞系，該突變體與早發(fā)型阿爾茨海默氏病相關(guān)。 |
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| Panel A. 使用包含PAM沉默突變的HDR模板，在PSEN1基因座上進(jìn)行準(zhǔn)確基因編輯：如果同源重組成功，編輯后的PSEN1基因座將編碼鄰近PAM序列發(fā)生沉默突變（紅色，小寫(xiě)）的SNP（藍(lán)色，小寫(xiě)）或者WT（紫色，小寫(xiě)）等位基因。 Panel B. 基因組編輯后在批量iPS細(xì)胞群中成功檢測(cè)堿基替換：使用正義或者反義HDR模板進(jìn)行基因編輯，然后使用Guide-it Knockin Screening Kit檢測(cè)是否在每種情況下都成功發(fā)生了基因編輯。 設(shè)計(jì)displacement和flap-probe oligos，用于檢測(cè)由相應(yīng)HDR模板編碼的鄰近PAM序列發(fā)生沉默突變（G>C）的WT或者SNP等位基因，將分別產(chǎn)生紅色和綠色熒光信號(hào)。在獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)中，將Cas9蛋白質(zhì)（陰性對(duì)照），Cas9-sgRNA RNP復(fù)合物（KO）或者RNP復(fù)合物和正義或者反義WT/SNP HDR模板混合物通過(guò)電穿孔的方式分別導(dǎo)入至細(xì)胞中。合成檢測(cè)PAM序列沉默突變的WT或SNP編碼序列的寡核苷酸探針，進(jìn)行平行檢測(cè)并作為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)于每個(gè)電穿孔混合物中包含HDR模板的編輯實(shí)驗(yàn)組，可以在批量細(xì)胞群中檢測(cè)到成功的HDR。陰性對(duì)照組沒(méi)有顯示綠色和紅色熒光信號(hào)，這證實(shí)了flap-probe oligos的特異性，因?yàn)樵谖淳庉嫷腤T序列存在下它們沒(méi)有產(chǎn)生假陽(yáng)性熒光信號(hào)。 |
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| ■ 產(chǎn)品組份 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| ■ 保存 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MightyPrep Reagent for DNA：4℃ |
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| 其它：－20℃ |
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頁(yè)面更新：2020-03-05 11:13:01
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