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檢測基因編輯后細(xì)胞群中的單核苷酸替換
Guide-it SNP Screening Kit |
· 高通量SNP篩選，無需測序
· 操作流程簡單、快速，4小時可完成
· 在任意基因位點檢測任意核苷酸替換
· 無論是哪種合子型，都可以識別出基因編輯后的細(xì)胞克隆
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| Guide-it SNP Screening Kit可以檢測CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯后的細(xì)胞群中的單核苷酸替換，在96孔板中快速識別出基因編輯后的細(xì)胞克隆。整個操作流程簡單快速，首先通過PCR擴增基因組靶標(biāo)位點，之后使用識別特定結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，然后讀取熒光值就可以完成單核苷酸替換檢測。無論需要檢測的核苷酸替換類型、細(xì)胞克隆的接合性或者靶標(biāo)位點的基因序列如何，都可以使用這個方法進(jìn)行檢測。了解此試劑盒的原理以及更多產(chǎn)品特點，您可以登錄FAQs頁面觀看視頻錄像。 |
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| 基因編輯技術(shù)其中一個強大的應(yīng)用，就是在特定的基因組位點導(dǎo)入核苷酸替換，去模擬與人類疾病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)或者插入終止密碼子以實現(xiàn)準(zhǔn)確的基因敲除。然而，要從數(shù)以百計的克隆中篩選出一個對單核苷酸進(jìn)行了編輯的細(xì)胞克隆，這對我們來說仍然是一個挑戰(zhàn)，尤其是在沒有相應(yīng)的表型的情況下。而Guide-it SNP Screening Kit可以充分滿足這個需求，讓您在數(shù)百個細(xì)胞克隆中輕松篩選出單核苷酸編輯。 |
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| 應(yīng)用： |
· 快速檢測基因編輯后細(xì)胞群中的單核苷酸替換
· SNP基因分型
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| Video & FAQs |
| SNP Screening Kit Video & FAQs |
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| 實驗例： |
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圖1 Guide-it SNP Screening Kit 操作流程示意圖。此示范操作流程描述了G>A替換（野生型鳥嘌呤編輯為腺嘌呤）的檢測過程。基因編輯后，通過FACS或者有限稀釋法分離單細(xì)胞并擴大培養(yǎng)成為克隆細(xì)胞系，野生型（G，上面）細(xì)胞系和核苷酸編輯成功的細(xì)胞系（A，下面）。之后提取基因組DNA，PCR擴增靶標(biāo)位點附近的序列區(qū)域，所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物（藍(lán)色）會與兩個不同的互補寡核苷酸——一個displacement oligo（綠色）和一個 flap-probe oligo (深/淺紫色)進(jìn)行雜交，flap-probe oligo 5’端包含一段不互補的固定序列（淺紫色），這段序列形成了flap。Oligos與PCR產(chǎn)物相雜交會形成以上兩種結(jié)構(gòu)中的其中一種結(jié)構(gòu)，當(dāng)然這取決于基因編輯的結(jié)果。當(dāng)基因編輯成功發(fā)生時，flap-probe oligo在靶標(biāo)位點形成完全的堿基配對，這時候產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)是一個double-flap結(jié)構(gòu)（下面）。Double-flap結(jié)構(gòu)由Guide-it Flap Detector識別檢出，Guide-it Flapase核酸酶特異性剪切并釋放出flap，從而產(chǎn)生熒光信號。當(dāng)沒有發(fā)生基因編輯時，flap-probe oligo在靶標(biāo)位點不會形成完全的堿基配對，從而形成一個帶有缺口的結(jié)構(gòu)（上面），這個結(jié)構(gòu)不能被Guide-it Flapase核酸酶剪切，也就不會產(chǎn)生熒光信號。通過這種方式，使用Guide-it SNP Screening Kit檢測熒光信號就可以確認(rèn)是否發(fā)生了預(yù)期的核苷酸替換。
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圖2 比較純合子、雜合子和野生型細(xì)胞樣品的SNP篩選結(jié)果。分別以純合子、雜合子和野生型細(xì)胞為樣品，使用Guide-it SNP Screening Kit檢測所標(biāo)明的核苷酸替換。在每一組檢測結(jié)果中，在純合子和雜合子樣品（分別為藍(lán)色和紫色）中所檢測到熒光信號值相差不大。
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圖3 使用Guide-it SNP Screening Kit檢測基因分型。本實驗例中的SNPs樣品均來自于Coriell研究所，這些樣品在兩個基因組位點（NCP1或者CFT基因）中的其中一個位點上攜帶了SNPs。使用Guide-it SNP Screening Kit（柱形圖）和Sanger測序進(jìn)行分析。Panel A. NCP1基因型分析。使用分別檢測A或者G的兩個flap-probe oligos獨立進(jìn)行實驗，分析確定哪些樣品是A>G替換的純合子，哪些是雜合子。Panel B. CFTR基因型分析。分析確定哪些樣品是沒有發(fā)生T>A替換的野生型，哪些是T>A替換的純合子。所有檢測結(jié)果都通過Sanger測序進(jìn)行了確認(rèn)（結(jié)果顯示在柱形圖下面每個樣品的下方）。
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圖4 利用Guide-it SNP Screening Kit在多個人類基因組位點檢測核苷酸替換。以野生型或者純合子來源的基因組DNA（從Coriell研究所獲?。闃悠?，使用Guide-it SNP Screening Kit分析所標(biāo)明的堿基替換。結(jié)果表明所有的堿基替換均可以被成功檢測到，與野生型（橙色）和陰性對照（灰色）樣品所獲得的熒光信號相比，發(fā)生了所標(biāo)明的核苷酸替換的純合子（藍(lán)色）樣品產(chǎn)生了強熒光信號就可以說明這一點。
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| ■ 產(chǎn)品組份 |
| · MightyPrep Reagent for DNA |
| · Guide-it SNP Positive Control Mix |
| · Guide-it SNP Negative Control Mix |
| · Terra PCR Direct Polymerase Mix |
| · 2X Terra PCR Direct Buffer (with Mg2+, dNTP) |
| · Dilution Buffer |
| · RNase-free Water |
| · Annealing Buffer |
| · Flapase Buffer |
| · Guide-it Flapase |
| · Guide-it Flap Detector (40X) |
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京公網(wǎng)安備 110114000405號
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