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無標(biāo)題文檔

拆開錦囊讀妙計(jì)
Takara助你輕松應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)純化、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

蛋白質(zhì)的分離純化在生物化學(xué)研究應(yīng)用中使用廣泛，是一項(xiàng)重要的操作技術(shù)。一個(gè)典型的真核細(xì)胞可以包含數(shù)以千計(jì)的不同蛋白質(zhì)，為了研究某一個(gè)蛋白質(zhì)，必須先將它從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)的分子中純化出來。

蛋白質(zhì)純化常規(guī)流程

親和層析是一種常見的蛋白質(zhì)純化方法，它利用生物大分子與配基特異性結(jié)合（這種結(jié)合在一定的條件下是可逆的），達(dá)到分離提純的目的，這種可逆結(jié)合的作用主要是靠生物大分子對(duì)它的配基的空間結(jié)構(gòu)的識(shí)別。
蛋白質(zhì)印跡（Western Blotting）是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)的常見方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)，能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和半定量分析。
今天向大家介紹的就是采用親和層析的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)純化以及用Western Blotting進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)這一部分的實(shí)驗(yàn)應(yīng)對(duì)方案。

對(duì)His-tag蛋白質(zhì)進(jìn)行純化

His標(biāo)簽是從事重組蛋白質(zhì)表達(dá)研究的科研工作者們常用的標(biāo)簽蛋白質(zhì)之一，通過它可以快速和高效的完成蛋白質(zhì)純化。

標(biāo)簽蛋白質(zhì)純化原理（以TALON樹脂為例）

針對(duì)各位His-tag蛋白質(zhì)純化不同的實(shí)驗(yàn)要求，Takara制作了幾個(gè)錦囊妙計(jì)，可以讓大家在面對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)難題選擇合適的實(shí)驗(yàn)方法。

需求1：想要得到收量更多帶His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)！
錦囊：使用His60系列鎳離子樹脂純化His標(biāo)簽蛋白質(zhì)，產(chǎn)物收量高，可以達(dá)到60 mg/ml樹脂，適用于大量制備。

His60 鎳離子樹脂是一個(gè)高容量的Ni-IDA樹脂，可以從細(xì)菌、哺乳動(dòng)物和桿狀病毒感染的細(xì)胞中，一步純化重組的His標(biāo)簽蛋白。該產(chǎn)品屬于改良型的Ni-IDA樹脂，相比于其他Ni-NTA或Ni-IDA樹脂來說，容量高、金屬離子泄漏少，純度高。

需求2：想要得到純度更高的帶His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)！
錦囊：使用TALON系列鈷離子樹脂純化His標(biāo)簽蛋白質(zhì)，產(chǎn)物純度高，收量可達(dá)20 mg/ml樹脂，適用于高純度制備。

TALON是一種螯合固定鈷離子的固定化金屬離子親和層析（IMAC）樹脂，相比于鎳離子樹脂而言，結(jié)合His標(biāo)簽蛋白的特異性更高。因此，使用TALON樹脂純化可獲得更高純度的His標(biāo)簽蛋白。

需求3：和時(shí)間賽跑，想更加快速的純化His標(biāo)簽蛋白質(zhì)！
錦囊：使用Capturem™ His-Tagged系列產(chǎn)品可以用于His標(biāo)簽蛋白質(zhì)的前期小量、快速以及大規(guī)模的篩選和驗(yàn)證。而使用大體積樣品純化套組，至多可純化500 ml大體積樣品，收量達(dá)25 mg/unit，時(shí)間僅需10-30 min。

Capturem™ His-Tagged Purification Kit是以鎳離子為配基，結(jié)合Capturem™ 新型膜技術(shù)開發(fā)的用于His標(biāo)簽蛋白質(zhì)快速分離純化的產(chǎn)品。與傳統(tǒng)的固定化金屬離子樹脂相比，Capturem™ 系列產(chǎn)品以高性能的尼龍膜為介質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行改造，增加了膜孔表面積，對(duì)His標(biāo)簽蛋白質(zhì)的結(jié)合能力≥75 mg/cm³。

基于Capturem™技術(shù)的His標(biāo)簽蛋白質(zhì)純化方法實(shí)驗(yàn)流程：

需求4：想更快速、高效的完成免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
錦囊：Capturem™ IP & Co-IP Kit可以用于少量樣品的Co-IP實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)操作速度快，抗體與樣品孵育之后在室溫下進(jìn)行的純化僅需5 min，由于洗脫液體積小，最終產(chǎn)物不會(huì)被大量稀釋。而由于樣品的處理更加快速，所以又避免了產(chǎn)物凝結(jié)或者失活，使產(chǎn)物質(zhì)量得到保障。

Capturem™快速免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程：

需求5：想快速獲得抗體純化產(chǎn)物！
錦囊：Capturem™ Protein A和Capturem™ Protein G系列產(chǎn)品是結(jié)合Capturem™膜技術(shù)的一次性抗體純化柱，特別適用于單克隆抗體和多克隆抗體的小量快速純化和篩選。室溫下操作即可，小量純化操作僅需5 min，因此無須擔(dān)心抗體的降解或失活。

基于Capturem™技術(shù)的抗體純化柱使用流程：

需求6：如何利用鏈霉親和素快速富集生物素化蛋白質(zhì)？
鏈霉親和素是一種來源于鏈霉菌Streptomyces avidinii的細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，與生物素有非常強(qiáng)的親和力，這一特性常被用在生物素化物質(zhì)富集等相關(guān)研究。
錦囊：Capturem™ Streptavidin系列是將鏈霉親和素固定在高容量的Capturem膜上，從而在室溫條件下就可以對(duì)生物素化的靶標(biāo)實(shí)現(xiàn)快速、高質(zhì)量的純化和富集，整個(gè)操作從上樣到洗脫僅需5～15分鐘。此外，還可以利用Capturem™ Streptavidin來捕獲或pull down靶標(biāo)分子或復(fù)合物。

應(yīng)對(duì)Western Blotting實(shí)驗(yàn)

需求1：如何降低背景影響
錦囊：可以使用Western BLoT Blocking Buffer (Fish Gelatin) ，制品添加了魚源明膠的封閉緩沖液，同哺乳動(dòng)物來源的奶粉和BSA相比，不會(huì)與哺乳動(dòng)物來源抗體出現(xiàn)非特異性交叉反應(yīng)，能夠明確地檢測(cè)出特異性抗原。由于是即用型試劑，無需稀釋，可直接用于封閉Western印跡膜；也可作為一抗、HRP或AP標(biāo)記二抗的稀釋液。也可以使用Western BLoT Blocking Buffer（Protein Free）化學(xué)成分的封閉緩沖液，不含蛋白質(zhì)，同樣是即用型試劑。

需求2：進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)時(shí)，如何研討最佳實(shí)驗(yàn)條件？
由于目的蛋白質(zhì)的濃度和使用的抗體濃度不同，膠片曝光條件也不同，所以有必要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)探討最佳實(shí)驗(yàn)條件。而使用專用緩沖液從膜上將一抗、二抗和檢測(cè)試劑去除后可在同一膜上進(jìn)行目的蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)的再次檢測(cè)，由此對(duì)檢測(cè)的最佳條件進(jìn)行探討。
錦囊：使用Western BLoT Stripping Buffer能在室溫下從膜上溫和剝離一抗和二抗但不影響膜上結(jié)合的待檢測(cè)蛋白質(zhì),有助于實(shí)驗(yàn)者重新研討、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,在同一張膜上進(jìn)行目的蛋白質(zhì)的再次檢測(cè)。

需求3：增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度
錦囊：Western BLoT Immuno Booster 適用于包括Western印跡和ELISA在內(nèi)的各種免疫檢測(cè)，可提高最終的檢測(cè)靈敏度(從數(shù)倍到數(shù)十倍)。
Western BLoT Immuno Booster PF 不含蛋白質(zhì)，可與Western BLoT Blocking Buffer（Protein Free）聯(lián)用，在不含外源蛋白質(zhì)的體系下進(jìn)行檢測(cè)和分析。

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Western Blotting實(shí)驗(yàn)操作指南

頁面更新：2021-10-22 10:58:24

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