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引物設(shè)計(jì)是決定PCR反應(yīng)成敗的最重要因素。引物設(shè)計(jì)有兩個(gè)主要考慮因素：特異性和擴(kuò)增效率。
· 特異性是由錯(cuò)配的頻率決定的。特異性差的引物易產(chǎn)生不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物。
· 擴(kuò)增效率是指引物以每循環(huán)增加兩倍擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到理論最優(yōu)的能力。
下表提供了引物設(shè)計(jì)的指南。

引物Tm值用來評(píng)價(jià)DNA-DNA雜交鏈穩(wěn)定性。了解Tm值對(duì)于確定適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟仁侵陵P(guān)重要的。過高的退火溫度會(huì)導(dǎo)致引物-模板雜交不足，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物產(chǎn)率低。退火溫度過低可能導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。
低于20個(gè)堿基的引物Tm值的計(jì)算，可以使用如下Wallace法則：
Tm = 2℃ (A+T) + 4℃ (G+C)
超過20個(gè)堿基的引物Tm值的計(jì)算，我們推薦使用免費(fèi)的引物設(shè)計(jì)軟件，比如Primer3。

可以不考慮Inosine堿基，使用A、G、C、T計(jì)算Tm值就可以。

有影響。簡(jiǎn)并數(shù)量應(yīng)盡量少。
通常一條引物中簡(jiǎn)并的堿基不要超過4處，如果簡(jiǎn)并的堿基數(shù)過多，則會(huì)造成反應(yīng)體系中有效引物的量相對(duì)減少，此時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加引物的使用量。但引物量過大，容易引起非特異擴(kuò)增，應(yīng)加以注意。

每種引物的最終濃度應(yīng)在0.1至0.5 μM之間。每種引物的工作液濃度通常為10-20 μM。
· 小于10 kb的PCR擴(kuò)增，0.2 μM的引物終濃度即可產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果。
· 使用TaKaRa LA Taq DNA polymerases 或者TaKaRa Ex Taq DNA polymerases擴(kuò)增長(zhǎng)片段(～17 kb)，可將引物終濃度提高到1 μM。
· Advantage 2 DNA polymerases 和 Titanium Taq DNA polymerases等高收量聚合酶，推薦的引物終濃度為0.4 μM。
過高的引物濃度會(huì)增加錯(cuò)配的可能，這可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。過低的引物濃度則可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率低。

標(biāo)準(zhǔn)脫鹽引物對(duì)大多數(shù)PCR應(yīng)用的效果是比較令人滿意的。

最適模板添加量取決于模板的復(fù)雜程度和目的基因拷貝數(shù)。25-30圈循環(huán)，可以檢測(cè)到大約10⁴拷貝的目的基因序列。
· 通常1 μg的人類基因組DNA含有3.04 x 10⁵ 個(gè)DNA分子。對(duì)于大多數(shù)PCR反應(yīng)來說，30-100 ng的人基因組DNA就足夠了。高拷貝的目的序列，如管家基因，只需要10 ng的模板。復(fù)雜度較高的模板添加量范圍在10 ng至500 ng之間。
· 通常1 μg大腸桿菌基因組DNA含有2 x 10⁸ 個(gè)DNA分子；因此，模板的推薦量在100 pg和1 ng之間。
· 通常1 μg的λDNA含有1.9 x 10¹⁰ 分子DNA；因此，模板添加量可以少至100 pg。
· cDNA模板的數(shù)量取決于目的序列的拷貝數(shù)。cDNA添加量通常用等效RNA添加量。PCR反應(yīng)中cDNA的含量可以低至10 pg (RNA當(dāng)量)。
值得注意的是，并非所有的聚合酶都能耐受過量的模板。對(duì)于含有過量模板（高達(dá)1 μg）的樣品，我們建議使用 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase。

模板質(zhì)量：
DNA完整性對(duì)于長(zhǎng)片段的擴(kuò)增至關(guān)重要。DNA損傷（例如在DNA純化過程中DNA斷裂，或者在高溫和低pH下DNA脫嘌呤）導(dǎo)致產(chǎn)生大量不完整擴(kuò)增產(chǎn)物，降低總產(chǎn)量。DNA損傷也可以在酸性條件下發(fā)生。因此，避免用水重懸DNA模板，DNA在pH 7-8或緩沖溶液中最穩(wěn)定。

PCR條件
· 變性時(shí)間應(yīng)保持在最低限度，以減少脫嘌呤。
· 使用touchdown PCR;在較高的退火溫度下開始，持續(xù)幾個(gè)循環(huán)以后，每循環(huán)減少2℃退火溫度。
· 設(shè)計(jì)Tm值高于68℃的引物。

PCR酶

我們提供幾種適用于長(zhǎng)鏈PCR的聚合酶?？梢愿鶕?jù)GC含量和擴(kuò)增片段大小來靈活選擇 TaKaRa LA Taq DNA polymerase, TaKaRa LA Taq Polymerase with GC Buffer, 和 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase。

GC含量在不同基因組中各不相同。GC含量超過65%的模板被認(rèn)為是GC-rich模板。基因組中富含GC的區(qū)域主要集中在調(diào)控區(qū)域，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和順式調(diào)控元件。富含GC的區(qū)域容易形成反向重復(fù)，或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使PCR退火過程不能順利進(jìn)行。因此，因?yàn)閮蓷lDNA鏈分離效率低的原因，GC-rich模板的擴(kuò)增比較困難，這也導(dǎo)致了由于聚合酶延伸過早終止而導(dǎo)致的擴(kuò)增片段不完整。

PCR反應(yīng)條件

· 使用較高的變性溫度(例如98℃，而不是94℃或95℃)以允許模板完全變性。
· 盡量縮短GC-rich模板的退火時(shí)間。
· 使用Tm值較高的引物(>68℃)，因?yàn)橥嘶鹂梢栽谳^高的溫度下進(jìn)行。

PCR聚合酶
使用經(jīng)過優(yōu)化后適用于擴(kuò)增GC-rich序列的聚合酶。如何選擇合適的PCR聚合酶，請(qǐng)參考官網(wǎng)“PCR Enzyme的選擇”。

我們從客戶那里了解到，使用PrimeSTAR MAX DNA Polymerase 或CloneAmp HiFi PCR Premix，通過向反應(yīng)中添加DMSO，可以提高GC-rich模板的擴(kuò)增效果。DMSO的推薦濃度在2.5%到5%之間。

有些模板可能有很長(zhǎng)的AT-rich延伸序列，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下很難擴(kuò)增。如惡性瘧原蟲基因組中AT約占80%，其側(cè)翼基因區(qū)往往富含AT。
推薦用于GC-rich模板的聚合酶，如EmeraldAmp^® GT PCR Master Mix, EmeraldAmp^® MAX PCR Master Mix和 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase等，也適用于AT-rich模板擴(kuò)增。
使用AT-rich模板的優(yōu)點(diǎn)是可以使用較低的延伸溫度。對(duì)于某些含量為80-5% AT的模板，延伸溫度可以從72℃降低到65-60℃。在這種降低的溫度下，DNA復(fù)制似乎是可靠的(Su et al. 1996)。

■ 參考文獻(xiàn)
Su, X. Z., et al. Reduced Extension Temperatures Required for PCR Amplification of Extremely A+T-rich DNA. Nucl Acids Res. 24, 1574-1575 (1996).

鎂離子是熱穩(wěn)定DNA聚合酶所必需的輔助因子，對(duì)成功擴(kuò)增具有重要意義。如果沒有足夠的游離Mg²⁺，PCR聚合酶的活性會(huì)降低。相反，過量的游離Mg²⁺會(huì)降低酶的保真度，并可能增加非特異性擴(kuò)增。許多因素可以影響反應(yīng)中游離Mg²⁺的數(shù)量，包括DNA模板濃度、樣品中的螯合劑(如EDTA或檸檬酸鹽)、dNTP濃度以及蛋白質(zhì)的存在。
· 某些聚合酶(如TaKaRa Ex Taq DNA polymerases和TaKaRa LA Taq DNA polymerases)配有不含鎂離子的反應(yīng)緩沖液和單獨(dú)的25 mM MgCl2。對(duì)于這些酶，你可以優(yōu)化每個(gè)反應(yīng)的Mg²⁺濃度。
· Titanium Taq DNA polymerases和Advantage 2 DNA polymerases是鎂離子耐受性聚合酶，其緩沖液中含有3.5 mM的MgCl2。
· PrimeSTAR GXL DNA Polymerase和PrimeSTAR MAX DNA Polymerase反應(yīng)的Mg²⁺最終濃度為1 mM；該濃度增加了這些酶的保真度

成功的PCR需要DNA雙鏈在變性過程中分離，引物退火至變性DNA。鹽能中和DNA磷酸鹽骨架上的負(fù)電荷，通過抵消相互排斥的負(fù)電荷來穩(wěn)定雙鏈DNA。氯化鉀(KCl)通常用于PCR擴(kuò)增，終濃度為50 mM。為了提高DNA片段擴(kuò)增效果，特別是100-1,000 bp片段的擴(kuò)增，建議KCl濃度為70-100 mM。對(duì)于長(zhǎng)片段的擴(kuò)增，較低的鹽濃度似乎更有效，而短片段的擴(kuò)增則以較高的鹽濃度為佳。這種效應(yīng)可能是因?yàn)楦啕}濃度優(yōu)先允許短鏈DNA而不是長(zhǎng)鏈DNA變性。
值得注意的是，鹽濃度超過50 mM會(huì)抑制Taq聚合酶活性。

最初的變性步驟
有時(shí)需要預(yù)熱使復(fù)雜模板變性(例如基因組DNA)；94℃1分鐘足以使其變性。過度熱處理可能會(huì)導(dǎo)致酶失活。
· 用于直接PCR擴(kuò)增而不需要DNA提取純化的MightyAmp^™ DNA Polymerase Ver.3，需要在98℃預(yù)熱2 min
· 對(duì)于TaKaRa LA Taq DNA polymerases和Advantage GC 2 DNA polymerases，需要一個(gè)初始變性步驟
· PrimeSTAR酶不需要預(yù)熱來激活酶

變性條件
應(yīng)根據(jù)您所使用的熱循環(huán)儀來選擇變性條件。通常使用94-95℃，30秒或98℃，10秒。
如果使用耐熱酶，如PrimeSTAR系列聚合酶中的一種，我們建議使用短時(shí)間和高溫的變性步驟。（例如98℃，5-10秒）
溫度過高或變性時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致酶活性喪失和/或長(zhǎng)模板的損傷。

退火條件
退火步驟應(yīng)針對(duì)每對(duì)引物進(jìn)行調(diào)整；退火溫度直接取決于引物的Tm值。使用過低的退火溫度可能導(dǎo)致錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，從而導(dǎo)致目的產(chǎn)物收率較低。
根據(jù)引物Tm調(diào)節(jié)退火溫度或進(jìn)行兩步PCR均可提高擴(kuò)增效率和特異性。
· 對(duì)于Taq酶，推薦退火時(shí)間為30秒。
· PrimeSTAR系列酶具有良好的priming效率。因此，使用5 - 15秒的短退火時(shí)間是非常重要的。過長(zhǎng)的退火時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)配--誘導(dǎo)的非特異性擴(kuò)增。
· 當(dāng)擴(kuò)增小于1 kb的短鏈時(shí)，推薦使用三步法PCR。對(duì)于富含GC的序列或長(zhǎng)片段擴(kuò)增(>10 kb)，推薦采用兩步法PCR。

延伸步驟
一般來說，建議延伸時(shí)間為1 min/kb。當(dāng)使用高速酶如SpeedSTAR HS DNA Polymerase或者SapphireAmp Fast PCR Master Mix時(shí)，對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)速率為10 sec/kb。（即對(duì)于1 kb的產(chǎn)物，延伸時(shí)間為10 sec。對(duì)于2 kb的產(chǎn)物，延伸時(shí)間是20 sec，等等）。
PrimeSTAR Max DNA Polymerase和PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 包含特別的延伸因子，允許在5-20 sec/kb下進(jìn)行高速反應(yīng)。如果將這些酶與含有過量模板的樣品一起使用，則應(yīng)使用1 min/kb的延伸時(shí)間。

三步法PCR包括變性、退火和延伸步驟。當(dāng)引物的Tm值低于延伸溫度或小于68℃時(shí)，推薦使用這種方法。
如果引物Tm值接近延伸溫度（72℃）或稍低一些，考慮使用兩步法PCR，包括變性步驟和合并的退火/延伸步驟。該方法的退火溫度不應(yīng)超過延伸溫度。

兩步法PCR擴(kuò)增較長(zhǎng)的模板(>4 kb)時(shí)，最好選擇68℃的延伸溫度。這種較低的延伸溫度通過降低影響擴(kuò)增的脫嘌呤速率，顯著提高了較長(zhǎng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量。
當(dāng)進(jìn)行三步法PCR時(shí)，應(yīng)使用72℃作為延伸溫度，用于擴(kuò)增短片段（<4 kb）。

聚合酶應(yīng)儲(chǔ)存在-20℃的無霜冰箱中（可接受范圍在-15℃到-23℃之間）。不建議在-70℃或-80℃下長(zhǎng)期儲(chǔ)存（超過一周）。酶不可以在室溫下保存。
在打開一管新酶之前，簡(jiǎn)單離心以集液于管底。

凍干的PCR預(yù)混物密封在原袋中，應(yīng)在室溫（20-22℃）下儲(chǔ)存。任何未使用的產(chǎn)品也應(yīng)儲(chǔ)存在室溫下(20-22℃)，放在原來的袋子中用干燥劑重新密封，或者放在干燥器里。

為避免污染，操作時(shí)應(yīng)戴手套，手指遠(yuǎn)離Tube管口。每次從原液管中取酶時(shí)，必須使用一個(gè)新的、干凈的槍頭。
當(dāng)從原管中吸取酶時(shí)，將槍頭的末端置于液體中合適的位置，使其能剛好獲得所需的酶量。槍頭的尖端不應(yīng)完全浸入酶溶液中，因?yàn)榧舛说耐獠繒?huì)被酶粘附，從而妨礙了準(zhǔn)確量取并且會(huì)浪費(fèi)酶。
注意: 槍頭對(duì)不同類型溶液的吸附性不同。當(dāng)液體不止一次被吸出時(shí)，槍頭尖端就會(huì)失去其準(zhǔn)確度。低保留量槍頭尖端推薦用于粘性溶液，如含有甘油的溶液。

DNA聚合酶的保真度指的是它能夠準(zhǔn)確復(fù)制模板，或者在引物的3'端加入正確的核苷酸。堿基錯(cuò)配的比率被稱為錯(cuò)配率。具有校正活性的PCR聚合酶具有3'→ 5'外切酶活性，可切除不正確的核苷酸并將其替換為正確的核苷酸。
高保真酶被推薦用于基因克隆、蛋白質(zhì)表達(dá)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究、cDNA文庫(kù)構(gòu)建和下一代測(cè)序?？蓞⒖脊倬W(wǎng)PCR Enzyme的選擇，選擇適合的高保真酶。

由于測(cè)量保真度的方法不同，生產(chǎn)商提供的聚合酶錯(cuò)配率并不總是可以直接比較的。這些方法包括：
1. 藍(lán)白斑篩選
該方法以表型變化為基礎(chǔ)，因其快速、相對(duì)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)有效而得到廣泛應(yīng)用。藍(lán)白斑篩選的原始方法，被稱為Kunkel方法（Kunkel和Tindall，1987），是基于lacZ基因的α-互補(bǔ)性，它能還原β-半乳糖苷酶基因活性，并產(chǎn)生藍(lán)色菌落。使用此方法，來自含有單核苷酸錯(cuò)配或移碼突變的lacZα PCR產(chǎn)物的菌落通常呈白色，而由無錯(cuò)誤擴(kuò)增子衍生的克隆則產(chǎn)生藍(lán)色菌落。
2. 測(cè)序的方法
該方法是對(duì)PCR后單個(gè)菌落進(jìn)行Sanger測(cè)序。藍(lán)白斑篩選法可以快速測(cè)定聚合酶的保真度，但不如測(cè)序法準(zhǔn)確。藍(lán)白斑篩選法檢測(cè)不到不影響翻譯的單核苷酸突變。而測(cè)序方法可以檢測(cè)到所有的突變，因此更加準(zhǔn)確。

■ 參考文獻(xiàn)
Kunkel, T. A. and Tindall, K. R., Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. Biochemistry27, 6008-6013 (1987).

PrimeSTAR系列的保真性是對(duì)PCR后單個(gè)菌落進(jìn)行Sanger測(cè)序后確定的，如下所示：
· 以GC-rich易發(fā)生堿基突變的Thermus thermophilus HB8基因組DNA為模板，任意選擇10個(gè)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
· 將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體上。
· 為每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物選擇多個(gè)克隆，并對(duì)PCR插入片段進(jìn)行測(cè)序。
PrimeSTAR Max DNA Polymerase的保真度是Taq聚合酶的29倍， PrimeSTAR GXL DNA Polymerase的保真度是Taq聚合酶的6.5倍。

所有用于多重PCR的引物對(duì)應(yīng)該對(duì)其目標(biāo)DNA序列有相似的priming效率。這可以通過使用相近的最佳退火溫度的引物來實(shí)現(xiàn)。
在設(shè)計(jì)引物時(shí)，要特別注意以下參數(shù)：
· 與目標(biāo)核酸序列的同源性
· 長(zhǎng)度
· GC含量
· 濃度
· 引物同源性(引物內(nèi)部或彼此之間不應(yīng)具有同源性，特別是在3'端)

巢式PCR是一種通過重復(fù)擴(kuò)增提高PCR結(jié)果的方法。巢式PCR需要設(shè)計(jì)一個(gè)新的正向嵌套（FN）或反向嵌套（RN）引物，該引物位于原始引物內(nèi)部，可以與原始引物配對(duì)。少量的初級(jí)PCR產(chǎn)物被用作嵌套引物的PCR模板。
巢式PCR通常通過以下方式提高所需PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量：
· 消除初級(jí)PCR中可能存在的非特異性條帶
· 增強(qiáng)在最初的PCR中可能很弱或不可見的特異性條帶
需要注意的是，在巢式PCR中，只應(yīng)該使用非常少量的初級(jí)產(chǎn)品作為模板，因?yàn)樵撃０宓男蛄袕?fù)雜度非常低。首先，將原PCR產(chǎn)物按照1:100稀釋，取1 μl稀釋液作為巢式PCR的模板。此外，可能需要將循環(huán)圈數(shù)減少到25-30圈。巢式PCR的最佳反應(yīng)條件應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。

在PCR變性過程中，所有的DNA分子都會(huì)變成單鏈。退火溫度降低時(shí)，可形成三種類型的雙鏈：
· 同源雙鏈--互補(bǔ)鏈退火
· 異源雙鏈--可能具有部分同源性的同源序列的雜交
· 引物和模板形成的雙鏈
為了獲得更高的特異性，在最初的PCR反應(yīng)周期中，應(yīng)通過增加嚴(yán)格性（即增加溫度）來減少異源雙鏈的形成。Touchdown PCR通過使用逐漸降低退火溫度的反應(yīng)條件來增加特異性。初始退火溫度設(shè)置比引物預(yù)估Tm值高幾度。在后續(xù)循環(huán)中，退火溫度逐漸降低，直至達(dá)到引物的計(jì)算退火溫度(Don 1991)。通過在最初的PCR周期中使用更高的退火溫度，touchdown PCR有助于積累引物-模板互補(bǔ)程度最高的序列，從而富集了最特異的擴(kuò)增子。在隨后的循環(huán)中轉(zhuǎn)換到較低的溫度會(huì)降低嚴(yán)格性，用已經(jīng)富集的特異性模板改善priming條件。我們建議在較高的退火溫度下執(zhí)行5 - 10個(gè)初始循環(huán)，然后逐漸降低溫度，直至最佳退火溫度或者"touchdown 溫度"。例如，如果引物的Tm值為68℃，則推薦的TD-PCR退火溫度為：
· 72℃，5個(gè)循環(huán)
· 70℃，5個(gè)循環(huán)
· 68℃，>25個(gè)循環(huán)

■ 參考文獻(xiàn)
Don, R. H., et al. 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucl Acids Res. 19(14):4008 (1991).

如果PCR產(chǎn)物由高保真聚合酶擴(kuò)增獲得，產(chǎn)生平滑末端，可以使用Taq聚合酶加A尾。下面提供了向PCR產(chǎn)物3’端加A尾的簡(jiǎn)要流程：
1. 純化PCR產(chǎn)物。在添加A尾之前，用PCR純化試劑盒或苯酚抽提和DNA沉淀的方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，去除反應(yīng)中所有的聚合酶是非常重要的。這一步至關(guān)重要，因?yàn)槿魏螝埩舻腄NA聚合酶的校正活性都會(huì)降解A尾，從而重新生成平滑末端。
2. 制備Taq DNA聚合酶反應(yīng)混合物：

*當(dāng)使用特定量的PCR產(chǎn)物時(shí)，加A尾反應(yīng)最有效。建議用量為： PCR產(chǎn)物10-100 ng/100 bp，即相當(dāng)于0.15-1.5 pmol PCR產(chǎn)物(見下表)。

3. 在72℃孵育20分鐘
繼續(xù)進(jìn)行TA克隆。為了獲得最佳的連接效率，最好使用新鮮的PCR產(chǎn)物，因?yàn)樵趦?chǔ)存過程中，3’端A尾會(huì)逐漸消失。

干擾PCR擴(kuò)增的雜質(zhì)稱為PCR抑制劑。PCR抑制劑存在于多種樣品類型中，可能導(dǎo)致PCR敏感性下降，甚至導(dǎo)致PCR結(jié)果假陰性。PCR抑制劑可能有無機(jī)物和有機(jī)物兩種來源(Schrader 2012)。

無機(jī)PCR抑制劑包括
· 鈣或其他金屬離子，會(huì)與鎂離子競(jìng)爭(zhēng)
· EDTA會(huì)與鎂離子結(jié)合，降低其濃度

一些有機(jī)PCR抑制劑包括：
· 多糖和類似核酸結(jié)構(gòu)的糖脂，會(huì)干擾引物與模板的結(jié)合
· 黑色素和膠原蛋白，能與DNA聚合酶形成可逆復(fù)合物
· 與模板DNA和聚合酶相互作用的腐植酸，即使在低濃度下也能阻止酶反應(yīng)
· 尿素可能會(huì)導(dǎo)致聚合酶的降解

其他可以抑制PCR的有機(jī)化合物包括：
· 血液、血清或血漿樣本中的血紅蛋白、乳鐵蛋白和IgG
· 抗凝血?jiǎng)?，如肝?br /> · 植物來源的多酚、果膠和木聚糖
· 乙醇、異丙醇、苯酚或洗滌劑，如SDS
如果模板制備中存在抑制劑，將起始模板進(jìn)行100倍稀釋，可以充分稀釋抑制劑并允許擴(kuò)增?；蛘撸赡苄枰獙?duì)模板進(jìn)行乙醇沉淀來解決這個(gè)問題。

■ 參考文獻(xiàn)
Schrader, C., et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113:1014-1026 (2012).

PCR過度循環(huán)是指循環(huán)超過擴(kuò)增的指數(shù)階段。當(dāng)PCR過程中存在以下情況時(shí)，即發(fā)生過度循環(huán)：
· 底物耗竭(dNTPs或引物)
· 試劑（dNTPs或酶）在變性溫度下不再穩(wěn)定
· PCR聚合酶受到產(chǎn)物(焦磷酸鹽、雙鏈DNA)的抑制
· 非特異性產(chǎn)物對(duì)試劑(dNTPs和引物)的競(jìng)爭(zhēng)
· 反應(yīng)的pH值降低
· 產(chǎn)物在高濃度下的不完全變性/鏈分離
在瓊脂糖凝膠上檢測(cè)時(shí)，PCR過度循環(huán)的標(biāo)志是強(qiáng)烈的拖尾，條帶難以區(qū)分。通常建議進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，以確定生產(chǎn)足夠產(chǎn)物所需的最少PCR循環(huán)圈數(shù)。如果產(chǎn)物產(chǎn)量每3～5個(gè)循環(huán)顯著增加，則PCR產(chǎn)物仍處于指數(shù)擴(kuò)增階段。我們發(fā)現(xiàn)，過度循環(huán)的cDNA不能為任何下游應(yīng)用提供合適的模板。

PCR聚合酶可以引入不同類型的突變，包括單堿基替換、缺失和插入。堿基替換通常是由DNA合成過程中不正確的dNTP的錯(cuò)誤插入引起的。
聚合酶可以在一個(gè)或多個(gè)核苷酸丟失或插入的位置產(chǎn)生突變。這種突變的頻率可能與序列有關(guān)，在高重復(fù)序列中可能更高。最常見的突變是單核苷酸缺失，這可能是由于模板與引物在一個(gè)重復(fù)的同源序列中不匹配導(dǎo)致的。當(dāng)聚合酶終止在一條DNA鏈上的合成，并在互補(bǔ)鏈上發(fā)生啟動(dòng)后繼續(xù)合成時(shí)，DNA重排也會(huì)發(fā)生(例如strand-switching或者jumping PCR)。這種突變發(fā)生在不同的DNA區(qū)域有高度同源性的情況下。反應(yīng)中過多的DNA模板也可能促進(jìn)這種類型的突變。

以下因素可導(dǎo)致PCR引入突變：

不平衡的dNTP濃度
不等量的四種dNTPs濃度可以增加8倍的堿基替換可能。
· 高的酶濃度
· 長(zhǎng)時(shí)間孵育
· 缺少3'→5'外切酶活性

    鎂離子濃度
    當(dāng)Mg²⁺濃度與dNTPs總濃度相等時(shí)，保真度最高。保真度隨著游離的二價(jià)陽離子濃度的增加而降低。
    反應(yīng)pH值
    將反應(yīng)的pH值降低3個(gè)單位可以使堿基替換量增加60倍。低pH值(<6.0)可導(dǎo)致自發(fā)性嘌呤遺失。
    DNA損傷
    DNA損傷可以在高溫下發(fā)生，可能會(huì)增加突變的速度。一個(gè)常見的突變是胞嘧啶脫氨生成尿嘧啶。
· 引物序列中存在的A延伸
    過度循環(huán)
    在最終的PCR循環(huán)中，當(dāng)DNA濃度增加時(shí)，錯(cuò)誤率增加?？傃h(huán)數(shù)應(yīng)保持在最低限度，以生產(chǎn)出沒有錯(cuò)誤
    的目的PCR產(chǎn)物。

以下是常見的PCR artifacts：
引物二聚體
引物二聚體在擴(kuò)增引物的3'端通過自互補(bǔ)形成。如果產(chǎn)物是在無模板反應(yīng)(陰性對(duì)照)中產(chǎn)生，則懷疑是引物二聚體。為了避免引物二聚體，引物的3'端不應(yīng)該有互補(bǔ)性。

嵌合PCR產(chǎn)物
嵌合PCR產(chǎn)物可能是由于模板不完全延伸造成的。換句話說，由于聚合酶過早終止而沒有完全復(fù)制的單鏈模板可以退火為部分同源模板。這就產(chǎn)生了嵌合的PCR產(chǎn)物。為了減少嵌合體，使用盡可能少的PCR擴(kuò)增循環(huán)。

PCR偏差
當(dāng)PCR引物優(yōu)先結(jié)合導(dǎo)致某些序列擴(kuò)增效率高于其他序列時(shí)，PCR就會(huì)發(fā)生偏差。如果一個(gè)序列在一個(gè)循環(huán)內(nèi)比另一個(gè)序列多擴(kuò)增10%，那么在30個(gè)循環(huán)后，這個(gè)序列的擴(kuò)增量將是另一個(gè)序列的17.4倍。為了減少PCR偏差，在變性和退火步驟之間使用高的升降溫速度，并使用低的退火溫度。應(yīng)避免較長(zhǎng)的延長(zhǎng)時(shí)間（>180秒）。

PCR漂移
PCR漂移是由于PCR試劑相互作用的隨機(jī)波動(dòng)，特別是在模板濃度非常低的早期循環(huán)。在多重分析中可以觀察到這種產(chǎn)物，不同引物之間的相互作用會(huì)導(dǎo)致靈敏度的降低。對(duì)這些情況要仔細(xì)分析，設(shè)計(jì)出合適的引物是很重要的。

· PCR產(chǎn)生的高分子量產(chǎn)物很難在瓊脂糖凝膠中遷移
對(duì)這種產(chǎn)物沒有很好的解釋。大多數(shù)研究人員認(rèn)為這是由于過度循環(huán)造成的，因?yàn)樵赑CR的后期，單鏈和雙鏈分子都會(huì)聚集。這種單鏈分子的積累可以通過與引物競(jìng)爭(zhēng)而產(chǎn)生雜雙環(huán)。當(dāng)PCR產(chǎn)物濃度較高時(shí)，后期的不完全變性會(huì)阻止DNA鏈分離，因此新形成的擴(kuò)增子可能仍然與先前制作的模板結(jié)合。這個(gè)過程可以重復(fù)，在分子網(wǎng)絡(luò)中捕獲PCR產(chǎn)物。
高分子量拖尾的來源，其另一種解釋是模板在初始PCR循環(huán)的部分延伸。當(dāng)引物或單鏈DNA退火并從一個(gè)啟動(dòng)位點(diǎn)延伸，然后部分退火至其他同源片段時(shí)，跳躍的產(chǎn)物可產(chǎn)生部分延伸(見上文嵌合PCR產(chǎn)物)。部分延伸的分子可以作為新的引物，因?yàn)樗鼈兒幸粋€(gè)游離的3’- OH，并且可以產(chǎn)生結(jié)合初始啟動(dòng)位點(diǎn)和“跳躍”位點(diǎn)的嵌合分子。
最后，當(dāng)使用粗提物模板進(jìn)行PCR時(shí)，也可以生成這類產(chǎn)物。直接從動(dòng)物或植物組織中擴(kuò)增出來的產(chǎn)物會(huì)被困在細(xì)胞碎片中，從而阻止它們?cè)谀z中遷移。這一問題可以通過對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行蛋白酶K消化來解決：
在整個(gè)50 μL的PCR反應(yīng)中加入15 μL含有蛋白酶K的loading buffer。
或者
在將樣品上樣電泳之前，將1 μl含有蛋白酶K的緩沖液添加至4 μl PCR反應(yīng)液中。

針對(duì)所有Takara Bio PCR酶
· 問題1：
引物不是特異性的
· 解決方案：
使用BLAST比對(duì)來確定引物的3’端是否有與目標(biāo)位點(diǎn)以外的位點(diǎn)互補(bǔ)。必要時(shí)可重新設(shè)計(jì)引物或調(diào)整PCR條件。
· 問題2：
PCR反應(yīng)條件不夠嚴(yán)格
· 解決方案：
1. 按照2℃梯度增加退火溫度
2. 使用touchdown PCR
3. 使用兩步法的PCR操作流程
4. 減少PCR循環(huán)圈數(shù)
· 問題3：
模板加量過多
· 解決方案：
2-5倍稀釋后添加，減少模板使用量

PrimeSTAR HS 和 PrimeSTAR Max DNA polymerases
· 問題：
退火時(shí)間過長(zhǎng)
· 解決方案：
為了獲得特異性擴(kuò)增，在進(jìn)行三步法PCR時(shí)，必須使用短的退火時(shí)間（5-15秒）

PrimeSTAR GXL DNA polymerases
· 問題：
引物Tm值不夠理想
· 解決方案：
擴(kuò)增1 kb以下的目的片段，請(qǐng)重新設(shè)計(jì)Tm值>55℃的引物，退火溫度設(shè)定在60℃。如果引物Tm值<55℃，嘗試設(shè)置5-10 sec/kb這樣較短的延伸時(shí)間。

TaKaRa Ex Taq和TaKaRa LA Taq DNA polymerases
· 問題：
非特異性引物在低溫下退火
· 解決方案：
TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq DNA polymerases的熱啟動(dòng)版本可以改善其中一些引物的擴(kuò)增結(jié)果。

SpeedSTAR HS DNA Polymerase
· 問題：
電泳檢測(cè)時(shí)PCR產(chǎn)物條帶拖尾
· 解決方案：
延伸時(shí)間過長(zhǎng)可能導(dǎo)致拖尾。SpeedSTAR HS DNA Polymerase的延伸時(shí)間一般建議為10～20秒/kb。如果PCR產(chǎn)量低，可以嘗試增加5圈循環(huán)圈數(shù)。

首先，使用陽性和陰性（無模板）對(duì)照來確定拖尾的來源?？梢源_定造成拖尾的原因是污染還是過度循環(huán)，或者是由引物設(shè)計(jì)不合理或PCR條件不理想產(chǎn)生的。 如果陰性對(duì)照為空白，則無污染。相反，需要優(yōu)化PCR條件；在調(diào)整PCR條件時(shí)需要考慮以下因素：
· 減少模板添加量
· 提高退火溫度
· 使用touchdown PCR
· 減少PCR循環(huán)圈數(shù)
· 重新設(shè)計(jì)引物
· 使用巢式引物
· 重新擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。（用槍頭挑取一小塊電泳膠，添加200 μl水后37°C孵育回收DNA。使用5 μl孵育液
   作為PCR模板進(jìn)行重新擴(kuò)增。）
如果陰性對(duì)照也出現(xiàn)拖尾，則存在污染。需要我們確定這種污染的來源?；蛟S有必要更換一下PCR試劑，并對(duì)移液器和實(shí)驗(yàn)臺(tái)清潔以去除污染（有關(guān)污染的更多信息，請(qǐng)參閱下面的問題）。

PCR污染主要有四種來源：
1. 最常見的污染源是來自以前擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物（被稱為“carryover contamination”）。當(dāng)在一段時(shí)間內(nèi)重復(fù)
  產(chǎn)生大量PCR產(chǎn)物（10¹²）時(shí)，污染的可能性隨之增加。
2. 另一個(gè)污染源是以前在實(shí)驗(yàn)室處理過的克隆DNA。
3. 樣品間的污染也可能發(fā)生。這種污染源最有可能在擴(kuò)增前需要廣泛處理的樣品中發(fā)現(xiàn)。
4. 減PCR反應(yīng)也可能被環(huán)境中的外源性DNA污染，包括存在于實(shí)驗(yàn)室設(shè)備上和用于DNA提取和PCR試劑中的DNA。

為了避免PCR過程中的錯(cuò)誤，我們建議使用高保真酶（參見PCR Enzyme的選擇）。
此外，一定要避免以下情況：
1. 過度循環(huán)
過度循環(huán)PCR反應(yīng)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)：
· 以破壞DNA穩(wěn)定性的方式改變反應(yīng)的pH值。
· 增加PCR產(chǎn)物的量，從而降低聚合酶的效率，導(dǎo)致錯(cuò)誤的發(fā)生
· 降低了dNTP的數(shù)量，從而增加由于不平衡的dNTP濃度而導(dǎo)致的堿基配對(duì)錯(cuò)誤的可能性。（如果使用Takara
   Bio的PCR酶，dNTP濃度優(yōu)化為200 nM；增加dNTP濃度會(huì)導(dǎo)致誤摻入。）
· 引起單鏈和雙鏈DNA的積累。
2. Mg²⁺濃度過高
Mg²⁺濃度范圍為1-5 mM。使用高濃度的Mg²⁺可以提高產(chǎn)量，但也可能影響酶的校正活性。然而，Mg²⁺濃度應(yīng)該始終高于dNTP濃度。
3. 模板DNA損傷
在分析或切膠回收PCR產(chǎn)物時(shí)，縮短紫外線照射時(shí)間。

需要。一般的PCR用引物5′末端都不帶磷 (除非在引物合成時(shí)已特別標(biāo)記)。使用這種引物進(jìn)行PCR的PCR產(chǎn)物經(jīng)末端平滑化后，與去磷酸的平滑末端載體連接之前，PCR產(chǎn)物必須進(jìn)行5′末端磷酸化。

在通常情況下，首先須把PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后再進(jìn)行限制酶的酶切反應(yīng)。但如果只使用PCR反應(yīng)液的一部分 (1～5 μl) 進(jìn)行酶切反應(yīng)時(shí)，可以不經(jīng)純化使用TaKaRa限制酶進(jìn)行20 μl體系的酶切反應(yīng)。

為保證各種PCR酶的使用效果，請(qǐng)務(wù)必將Buffer完全融解并充分混勻后使用。

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：①模板核酸的制備；②引物的質(zhì)量與特異性；③酶的質(zhì)量；④PCR條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析檢測(cè)。
一、 模板
a．模板中含有雜蛋白質(zhì)，特別是染色體中的組蛋白。
b．模板中含有Taq酶抑制劑。
c．提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。
d．模板核酸變性不徹底。
e．選擇質(zhì)量可靠的提取試劑。
f．靶序列變異。如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，導(dǎo)致PCR不能有效擴(kuò)增。
二、 引物：引物的設(shè)計(jì)、引物質(zhì)量是PCR擴(kuò)增成敗的關(guān)鍵。
a．引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠、引物之間形成二聚體等，需要重新設(shè)計(jì)引物。
b．合成高質(zhì)量、高純度級(jí)別的引物。
c．引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期4℃保存，導(dǎo)致引物降解失效。
三、 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或活性降低而導(dǎo)致沒有產(chǎn)物。
四、 PCR條件。
a．PCR擴(kuò)增條件：變性對(duì)PCR擴(kuò)增相當(dāng)重要，如變性溫度低、變性時(shí)間短都有可能出現(xiàn)擴(kuò)增無產(chǎn)物；退火溫度過低，可導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。
b．Mg²⁺濃度：Mg²⁺濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高會(huì)降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗。
c．反應(yīng)體系：通常進(jìn)行PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)采用的是小體系，正式實(shí)驗(yàn)如需擴(kuò)大體系時(shí)，一定要重新摸索條件，否則容易出現(xiàn)擴(kuò)增效果不理想或者失敗。

PCR擴(kuò)增出現(xiàn)的假陽性條帶與目的序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高，產(chǎn)生的原因有以下幾點(diǎn)：
1. 引物設(shè)計(jì)不合理
a．選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性序列。
b．靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。
2. 出現(xiàn)污染
a．整個(gè)基因組或大片段的交叉污染。
b．空氣中的小片段核酸污染。

進(jìn)行污染檢測(cè)的時(shí)候，關(guān)鍵是做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
1．陽性對(duì)照：PCR反應(yīng)都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。 需要注意有以下方面：
a．陽性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性樣品，添加量不要過多。
b．陽性對(duì)照對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大，因此操作的時(shí)候，PCR預(yù)混合液的配制和模板的填加一定要分區(qū)操作。
2．陰性對(duì)照：每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照，即在PCR試劑中不填加模板DNA或RNA，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從PCR擴(kuò)增的結(jié)果判斷試劑是否有污染。
3．重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。
4．選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)污染是來源于引物還是其他試劑。

防止污染及消除污染的方法有以下幾種：
1．合理分隔實(shí)驗(yàn)室：樣品的處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開，實(shí)驗(yàn)室最好能劃分為：
a．樣品處理區(qū)
b．PCR反應(yīng)預(yù)混液配制區(qū)
c．PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū)
d．PCR產(chǎn)物鑒定區(qū) 注意：各實(shí)驗(yàn)用品及移液器應(yīng)分區(qū)專用；實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。
2．移液槍：由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入移液器或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。
3．PCR試劑：每次使用時(shí)要多加小心，避免帶入污染。
4．Eppendorf管：應(yīng)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管。
5．防止操作人員污染：使用一次性手套、槍頭及離心管等。
6．避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體離心至管底部，同時(shí)開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。
7．適當(dāng)?shù)腜CR循環(huán)次數(shù)。
8．設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

特異性非常重要。20 mer左右的Primer，如果特異性高，擴(kuò)增20 kb沒有問題。
如果可能，根據(jù)以下原則制備引物：
1）長(zhǎng)度在25-30 bases。
2）引物間最適退火溫度相差2℃以內(nèi)。
3）選擇GC含量40-60%的引物。
4）避免引物形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物二聚體，尤其是3’末端。
5）避免使用序列中含inosine的引物。

請(qǐng)?jiān)诮K濃度為0.1 μM～1.0 μM的范圍內(nèi)進(jìn)行條件研討。引物的濃度過低時(shí)，有時(shí)擴(kuò)增量較?。欢锏臐舛冗^高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生非特異性帶。通常當(dāng)模板DNA的量較多或模板為復(fù)雜結(jié)構(gòu)（High Complexity）時(shí)，引物濃度應(yīng)低一些；而當(dāng)模板DNA的量較少或模板結(jié)構(gòu)不很復(fù)雜（Low Complexity；如質(zhì)粒等）時(shí)，引物濃度應(yīng)稍高一些。

50 μl的反應(yīng)體系可使用2.5 U的TaKaRa LA Taq。但合適的用量也與模板DNA的量、DNA的結(jié)構(gòu)、擴(kuò)增片段的大小等有關(guān)。酶量過多時(shí)，易發(fā)生非特異性反應(yīng)，電泳時(shí)出現(xiàn)Smear；酶量過少時(shí)，反應(yīng)性能下降。

模板DNA的質(zhì)量是LA PCR成功與否的重要因素。擴(kuò)增超過10 kb的DNA片段時(shí)，用簡(jiǎn)單的方法 (例如Cell只經(jīng)過加熱處理或Protease處理) 調(diào)制的DNA作模板不太合適， 建議使用充分精制的完整的DNA (沒有Nick等)。

可以。99℃、10 min處理后的噬菌體約10⁶～10⁷ pfu作為模板，至少可擴(kuò)增8 kb的DNA片段。

· 對(duì)E. coli只進(jìn)行熱處理可擴(kuò)增10 kb的DNA片段 (50 ml PCR反應(yīng)液中37℃ Overnight culture in L-both使用2 μl)。
· Human細(xì)胞 (培養(yǎng)細(xì)胞) 如只經(jīng)過熱處理，可擴(kuò)增數(shù)百bp；經(jīng)過Protease處理、 熱處理后的樣品，最多可擴(kuò)增1～2 kb。所以，如果要擴(kuò)增長(zhǎng)鏈DNA，建議使用經(jīng)過充分精制的完整的DNA作模板。

可以。使用TaKaRa LA Taq 及TaKaRa Ex Taq 時(shí)的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生A的Overhang，與使用TaKaRa Taq 時(shí)的PCR產(chǎn)物克隆于T-vector 的效率基本相同。

Long PCR成功的關(guān)鍵之一是設(shè)計(jì)30 mer以上的長(zhǎng)引物，以增加引物的特異性。而長(zhǎng)引物的Tm值一般較高，在進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，Annealing溫度和Extension溫度間的差距較小。當(dāng)Annealing溫度超過60℃時(shí)，Annealing溫度 和Extension溫度就可以設(shè)定在同一數(shù)值，此時(shí)進(jìn)行2階段溫度PCR反應(yīng)，效果頗佳。當(dāng)使用20 mer左右的引物進(jìn)行Long PCR時(shí)，進(jìn)行3階段溫度PCR反應(yīng)較好, 20 mer左右的引物也在諸多實(shí)驗(yàn)中成功地進(jìn)行過Long PCR。