疫情之下，Takara助攻新冠抗體藥物研發(fā) |
| 目前新冠疫情呈現(xiàn)全球性大爆發(fā)，抗體藥物和疫苗是兩種有效地應對策略，各相關企業(yè)及研究機構紛紛致力于新冠藥物的開發(fā)，以期能早日將特效藥推向臨床，戰(zhàn)勝疾病。 |
| 近年來，由于單克隆抗體（mAb）的高特異性、高活性、良好的藥代動力學特性以及成功的人源化改造策略，使得單克隆抗體（mAb）作為藥物應用于癌癥、神經(jīng)退行性疾病以及其他病癥的治療取得了相當大的成功。 |
| 3月31日，清華大學、深圳市第三人民醫(yī)院與騰盛博藥宣布簽署了關于新冠病毒全人源單克隆中和抗體的合作授權協(xié)議，力爭半年內(nèi)完成先導藥物篩選及人體首劑用藥的臨床試驗。此前，深圳市第三人民醫(yī)院與清華大學醫(yī)學院張林琦教授實驗室合作，從8個病人的血漿中獲得了206種針對新冠病毒S蛋白RBD的特異性抗體，那么如何快速從上百種抗體中篩選出適用于臨床藥物研發(fā)的抗體是一個巨大的挑戰(zhàn)。 |
| 抗體藥物篩選流程 |
 |
| 抗體藥物篩選通常的工作流程包括從B細胞擴增分離可變區(qū)的cDNA，然后將這些區(qū)域克隆到表達載體或做相應的分析以便于下一步應用，在表達后進一步純化、篩選表達的抗體并驗證其與靶點的相互作用。 |
| Takara針對抗體藥物篩選流程中涉及的大量的序列調(diào)取、克隆、表達以及純化操作，可提供巧妙、高效、快速的方法，為進行新冠抗體藥物研發(fā)的研究者提供新的思路和解決方案。 |
| 快速調(diào)取抗體可變區(qū)scFv序列 |
| 由于抗原抗體結合的特異性取決于抗體可變區(qū)的特異結構，所以分析可變區(qū)的序列是很多應用的第一步，這包括以噬菌體展示技術（用PCR技術從人免疫細胞中擴增出整套的抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因，克隆到噬菌體載體上并以融合蛋白質的形式表達在其外殼表面）為核心的大規(guī)模單抗篩選工作，以及對可變區(qū)結構進行穩(wěn)定優(yōu)化的抗體改造等工作。 |
| 分析可變區(qū)時，設計一個通用引物來擴增所有抗體序列是非常困難的，因為重鏈和輕鏈5’端的天然可變性決定了序列同源性很低，一個有效的方法是在可變區(qū)下游的保守區(qū)設計簡并引物，后續(xù)使用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法克隆這段目的區(qū)域，之后再進行測序。但普通的RACE方法常有擴增序列較短或操作步驟繁瑣的缺點，因此錯過了重要信息。 |
| Takara的SMARTer RACE cDNA合成技術可為抗體可變區(qū)的全長序列分析提供簡單、靈敏、高效的解決方案。SMARTer RACE cDNA擴增試劑盒，結合了Clontech特別的SMARTer（5'末端RNA模板轉換機制）技術，允許反轉錄酶達到轉錄本的5'末端，不需要adaptor連接等步驟，整個流程更快、更易操作，有效合成全長cDNA，大大減少了非特異性背景并提高了擴增效率。 |
 |
| BCR V(D)J可變區(qū)的快速分析 |
| B細胞抗原受體（B cell receptor, BCR）是B細胞表面負責特異性識別及結合抗原的分子，是科研人員研究機體獲得性免疫的重點關注對象。有資料顯示，每個個體的BCR多樣性高達5*1013，賦予個體識別各種抗原、產(chǎn)生特異性抗體的巨大潛能。BCR多樣性的重要意義不言而喻！ |
| BCR多樣性主要體現(xiàn)在BCR形成過程中V(D)J可變區(qū)域的重排，產(chǎn)生特定克隆型的BCR分子： |
 |
| BCR可變區(qū)序列重排后的成熟B細胞受到抗原刺激后，會經(jīng)歷高頻突變的發(fā)生、FDC捕獲抗原使表達高親和力BCR的B細胞免于凋亡等過程，幫助特異性抗體的進一步成熟，有助于機體有效抵抗外來抗原的再次入侵。因此，無論是探索機體免疫應答機制還是抗體研發(fā)等應用，BCR可變區(qū)序列的分析至關重要！ |
| NGS是BCR可變區(qū)序列分析的常見技術，而Takara的SMARTer Human BCR profiling kit是一種結合了5’RACE的BCR NGS建庫技術，所建文庫能完整分析BCR mRNA V(D)J的全長信息，添加的UMI能進一步提升測序結果的可靠性，搭配的Takara Bio Immune Profiler Software使得工作流程更完整更簡便！ |
 |
| SMARTer Human BCR profiling kit技術流程圖 |
| 【產(chǎn)品信息】 |
 |
| 抗體序列的高通量快速克隆 |
| 傳統(tǒng)酶切連接的克隆方法常存在缺陷：大片段連接效率低，核苷酸缺口，缺乏方向性以及載體/插入片段制備耗時。在研究某一個抗體時，這些缺陷造成的總體工作負荷延長可能還可以接受，但擴展至成百上千個克隆的高通量應用時問題就比較嚴重了，因為擴大化該工作流程就意味著擴大其潛在問題和增加了大量的故障排除工作。 |
| Takara的In-Fusion Cloning是一種無需連接酶、高效率的無縫克隆技術，基于載體和插入片段序列之間的同源重組原理，有助于快速、高效地將任意PCR片段克隆到任意目的載體中，背景低，克隆保證方向性，單片段克隆的成功率超過95％。In-Fusion克隆的快速和易用性以及結果的正確性，使系統(tǒng)可輕松應對高通量的工作流程。 |
 |
| 實驗案例：使用In-Fusion對抗體可變區(qū)進行高通量克隆。 |
| 【數(shù)據(jù)提供】Jared L. Spidel, Morphotek, Inc.* |
| 【客戶感言】 |
| “使用In-Fusion的陽性克隆率始終高于我們使用傳統(tǒng)的酶切連接法，這使我們能夠通過省略轉化后涂板的步驟來簡化我們的工藝流程并提高產(chǎn)量。由于大多數(shù)質粒都含有插入片段，我們可以將轉化的細菌培養(yǎng)成庫并直接進行小量制備。”——Jared L. Spidel，Morphotek，Inc. |
| 【實驗方法】 |
| 通過RT-PCR以從B細胞分離的RNA為模板擴增可變區(qū)（V）的cDNA，其中引物在5'末端含有15 bp與信號序列或恒定區(qū)（C）同源的序列。使用In-Fusion HD克隆將V區(qū)cDNA插入片段克隆到其C區(qū)線性化載體中。轉化后，每個轉化產(chǎn)物取50 μl加入到含1 ml TB的96-well深孔板中搖動培養(yǎng)過夜。對培養(yǎng)物進行質粒提取，并進行DNA測序以確認所需插入片段的存在。為了確定In-Fusion克隆的效率，將甘油菌種劃線并進行菌落PCR。 |
| 【實驗流程示意圖】 |
 |
| 抗體的快速高通量純化 |
| Takara的Capturem Protein A 和Protein G系列產(chǎn)品可以為抗體純化提供快速高通量的解決方案。該系統(tǒng)基于Capturem™膜技術，膜上偶聯(lián)了能夠特異性地與IgG的Fc片段結合的protein A或protein G，可滿足抗體小量快速純化和96 well大規(guī)?？焖俸Y選，兼具快速、易用、靈活和高產(chǎn)量（與同等體積樹脂比較）等特點。 |
| 【實驗操作流程】 |
| 使用Capturem Protein A會使工作流程更加連貫，減少抗體純化和篩選的工作量，從而產(chǎn)生高質量的抗體。操作過程就如同提質粒般簡單，每步操作之間進行1 min離心，小量純化的總凈化時間僅為5分鐘，96 well高通量純化可在15 min內(nèi)完成。膜的柱床體積<3 μl，超過80％的抗體可以用低至100 μl的洗脫液實現(xiàn)高濃度洗脫。 |
 |
| 【Capturem柱上快速標記抗體工作流程】 |
| 使用Capturem技術，可直接對未純化的起始材料進行快速的柱上偶聯(lián)，從而在15分鐘內(nèi)標記抗體。 |
 |
| 質譜檢測前抗體的快速酶解消化 |
| 使用質譜（MS）對抗體藥物進行準確的定性以及定量已經(jīng)成為抗體藥物研發(fā)過程中必不可少的環(huán)節(jié)，Takara的Capturem™ Trypsin和Pepsin可快速、有效地消化蛋白質樣品，在室溫下讓MS工作流程更加連貫。該系列產(chǎn)品應用我們的新型Capturem膜技術，膜上固定有胰蛋白酶（Trypsin）或胃蛋白酶（Pepsin），僅需2-3分鐘的時間即可高效消化蛋白質樣品，能進行獨立樣品酶解，也可進行96-well的高通量酶解操作。不僅可以節(jié)省時間，還可以通過減少胰蛋白酶自溶來改善蛋白質組學分析中肽和蛋白質的鑒定。 |
| 【Capturem™ Trypsin酶解消化工作流程】 |
 |
頁面更新：2020-06-01 09:13:38
|
使用規(guī)章丨聯(lián)系方式丨 關于個人信息的保護丨特別說明
寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司
Copyright ? 2015 Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. All rights reserved. 京ICP備06030419號-1
京公網(wǎng)安備 110114000405號
