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RT-PCR試劑盒PrimeScript^™ RT-PCR Kit
品牌	Code No.	產(chǎn)品名稱	包裝量	價(jià)格（元）	說明書	數(shù)量
Takara	RR014A	PrimeScript^™ RT-PCR Kit	50 Rxns	￥1,299
Takara	RR014B (A × 4)	PrimeScript^™ RT-PCR Kit	50 Rxns × 4	￥4,682

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無標(biāo)題文檔

■ 制品內(nèi)容 (Code No. RR014A ; 50 次量^*1)

PrimeScript RTase (for 2 Step)	25 μl
5 × PrimeScript Buffer	200 μl
RNase Inhibitor (40 U/μl)	25 μl
dNTP Mixture (10 mM each)	150 μl
Oligo dT Primer (2.5 μM)	50 μl
Random 6 mers (20 μM)	50 μl
TaKaRa Ex Taq HS (5 U/μl)	25 μl
10 × PCR BufferⅡ	250 μl
Control F-1 Primer^*2 (20 μM)	10 μl
Control R-1 Primer^*3 (20 μM)	10 μl
Positive Control RNA (2 × 10⁵ copies/μl)	20 μl
RNase Free dH2O	1 ml

1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)20 μl 、PCR反應(yīng)50 μl體系時(shí)可使用50次。 2 Positive Control RNA用上游引物。 *3 Positive Control RNA用下游引物。

■ 制品說明

PCR (Polymerase Chain Reaction；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 是一種使用兩條引物在目的DNA序列兩側(cè)擴(kuò)增特異性DNA片段的過程。它是一種體外擴(kuò)增DNA的簡(jiǎn)單而有效的方法，但RNA不能直接被擴(kuò)增。經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄酶的作用把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，PCR法便可應(yīng)用于RNA的解析了。目前，此方法已廣泛應(yīng)用于RNA的構(gòu)造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表達(dá)解析等多種領(lǐng)域。
PrimeScript RT-PCR Kit是具有良好的延伸性能與高擴(kuò)增效率的2 Step RT-PCR試劑盒。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用了Takara Bio Inc.特別開發(fā)的M-MLV由來的新型反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScript RTase；PCR反應(yīng)使用了擴(kuò)增性能良好的Hot Start 型DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS。本試劑盒具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1. 進(jìn)行高效的RT-PCR擴(kuò)增。
2. 在標(biāo)準(zhǔn)的RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度 (42℃) 下，便可使具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的RNA進(jìn)行良好的延伸，可以避免RNA在高溫條件下的降解。
3. 能有效抑制非特異性的PCR擴(kuò)增。
本試劑盒含有反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR擴(kuò)增反應(yīng)所需的全部試劑。

■ 各種引物的序列

引物名稱	各引物序列
Random 6 mers	pd (N)6
Oligo dT Primer	Takara Bio特別設(shè)計(jì)的dT區(qū)域^*
Control F-1 Primer	5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′
Control R-1 Primer	5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′

* 該序列和TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 (Code No. : RR019A/B) 的Oligo dT Adaptor Primer不同，不含有與M13 Primer M4匹配的序列。

■ Positive Control RNA

本試劑盒中的Control RNA是以pSPTet3質(zhì)粒 (質(zhì)粒中的SP6啟動(dòng)子下游插入長(zhǎng)約1.4 kb的pBR322來源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四環(huán)素基因) 為模板由SP6 RNA聚合酶經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄而得到的。

圖1. Positive Control RNA：使用Control Primer可以擴(kuò)增462 bp的DNA片段

■ 保存

-20℃。

■ RNA PCR 的原理

PrimeScript RT-PCR Kit首先用PrimeScript RTase將RNA合成cDNA，再取一部分1st strand cDNA作為模板，由TaKaRa Ex Taq HS進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的引物可以使用Random 6 mers、Oligo dT Primer或特異性下游引物。

圖2. PrimeScript RT-PCR Kit原理圖

圖3. PrimeScript RT-PCR Kit 的操作流程

■ 特點(diǎn)

RNA模板	適用于所有RNA
擴(kuò)增片段大小	～12 kb
反轉(zhuǎn)錄酶	PrimeScript RTase (反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)最適溫度42℃)
DNA Polymerase	TaKaRa Ex Taq HS
RNase Inhibitor	Kit中含有
合成第一條cDNA鏈的引物	Random 6 mers、Oligo dT Primer和特異性下游引物

■ 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)Primer的選擇

反轉(zhuǎn)錄引物的選擇，應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的具體情況，選擇以下三種引物，即：Random 6 mers、Oligo dT Primer或特異性下游引物。對(duì)沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的短鏈mRNA，上述三種引物都可以使用；一般情況下的反轉(zhuǎn)錄引物的選擇請(qǐng)參照以下說明。

Random 6 mers	適用于長(zhǎng)的或具有Hairpin構(gòu)造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在內(nèi)的所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)都可使用本引物。
Oligo dT Primer	適用于具有PolyA Tail的RNA。(注意：原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些種類的真核生物的mRNA等不具有PolyA Tail)。
特異性下游引物 (PCR時(shí)的下游引物)	必須與模板序列互補(bǔ)，需了解Target序列。

■ 使用注意

1. 當(dāng)同時(shí)需要進(jìn)行數(shù)次RT-PCR反應(yīng)時(shí)，應(yīng)先配制各種試劑的混合液，然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中。這樣，可使所取的試劑體積更準(zhǔn)確，減少試劑損失，避免重復(fù)分取同一試劑。同時(shí)也可以減少實(shí)驗(yàn)操作或?qū)嶒?yàn)之間產(chǎn)生的誤差。
2. 用PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、TaKaRa Ex Taq HS等酶類時(shí)，應(yīng)輕輕混勻，避免起泡；分取之前要小心地離心收集到反應(yīng)管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取時(shí)應(yīng)慢慢吸取。
3. 酶制品應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前才從-20℃中取出，使用后也應(yīng)立即放入-20℃保存。
4. 為了防止Positive Control RNA分解，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。有條件的實(shí)驗(yàn)室最好保存于-70℃～-80℃。
5. 分裝試劑時(shí)務(wù)必使用新的槍頭，以防止樣品間污染。

頁面更新：2023-11-01 16:21:58