本酶催化相鄰DNA鏈的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯鍵結(jié)合的反應(yīng),需Mg2+和ATP作輔因子,分子量為62,000,最適反應(yīng)pH為7.6。本酶可以催化粘性末端之間和平滑末端之間的DNA的連接。 |
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■ 保存 |
-20℃。 |
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■ 起源 |
Escherichia coli carrying the plasmid that encodes the gene of T4 DNA ligase |
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■ 活性定義 |
在20 μl的連接反應(yīng)體系中,6 μg的λDNA-Hind Ⅲ的分解物在16℃下反應(yīng)30分鐘時,有90%以上的DNA片段被連接所需要的酶量定義為1個活性單位 (unit)。
本酶的1 unit相當(dāng)于在含有6.6 mM MgCl2,10 mM DTT,66 μM ATP和3.3 μM [32P]-Na4P2O7的66 mM Tris-HCl (pH7.6) 中發(fā)生ATP-PPi交換反應(yīng)的0.008 Weiss Unit。
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■ 用途 |
1. DNA片段和載體DNA的連接。
2. DNA片段和Linker或Adaptor DNA的連接。
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■ 注意事項 |
連接反應(yīng)因末端堿基序列的不同而反應(yīng)速度各異,一般有下列傾向 (由快至慢):
突出末端:Hind III>Pst I>EcoR I>BamH I>Sal I
平滑末端:Hae III>Alu I>Hinc II>Sma I
EcoR V>Sca I>Pvu II>Nru I
其中連接Hind III 末端的速度約為連接Sal I 末端速度的10~40倍;
而連接Hae III 末端的速度約為連接Sma I 末端速度的5~10倍。 |