可以。根據(jù)本公司的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以上三種PCR用DNA Polymerase的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和TaKaRa Taq 一樣，在DNA片段的3′端有一個(gè)附加的"A" 堿基 (A Overhang)，可以進(jìn)行TA克隆。
TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 都具有3′→5′的Exonuclease活性，但這種活性TaKaRa LA Taq 強(qiáng)于TaKaRa Ex Taq。因此，TaKaRa LA Taq 的可信度強(qiáng)于TaKaRa Ex Taq，因而適合于進(jìn)行Long PCR。一般來(lái)說(shuō)，在擴(kuò)增數(shù)kbp的DNA片段時(shí)，從靈敏度、擴(kuò)增量、PCR條件的通用性等方面綜合考慮，使用TaKaRa Ex Taq 較佳；而擴(kuò)增15 kbp以上的DNA片段時(shí)，使用TaKaRa LA Taq 更好。
PCR反應(yīng)液請(qǐng)?jiān)诒信渲?，然后置于PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。這種冷啟動(dòng)法（Cool Start Method）與熱啟動(dòng)法（Hot Start Method）相結(jié)合，更能有效地減少PCR過(guò)程中的非特異性反應(yīng)，增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的特異性，能得到良好的PCR結(jié)果。
TaKaRa Ex Taq Hot Start是抗Taq單克隆抗體和TaKaRa Ex Taq的混合物，適用于Hot Start PCR。高溫加熱前，抗Taq單克隆抗體與TaKaRa Ex Taq酶結(jié)合，抑制聚合酶的活性，從而抑制低溫條件下由引物的非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增。抗Taq單克隆抗體在PCR反應(yīng)最初的DNA變性步驟已變性，因此無(wú)需特殊失活處理，在常規(guī)PCR反應(yīng)條件下即可使用。如果模板二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜或者GC含量高時(shí)，一定要預(yù)變性的話，可以做94℃小于5 min的預(yù)變性處理。
TaKaRa LA Taq with GC Buffer的制品包裝中添附有GC Buffer I 和GC Buffer II。其中GC Buffer II 的DNA變性效果強(qiáng)于GC Buffer I，因此，在實(shí)驗(yàn)時(shí)可先使用GC Buffer I，當(dāng)使用GC Buffer I 不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)再使用GC Buffer II。
應(yīng)注意使用Tm值較高的引物，因此，引物最好設(shè)計(jì)在30 mer以上。
TaKaRa公司曾經(jīng)擴(kuò)增過(guò)2 kb的GC含量在70%的DNA模板。同時(shí)也可應(yīng)用于200 bp～300 bp的短鏈DNA GC rich模板。
TaKaRa公司曾用GC Buffer I 成功地?cái)U(kuò)增了人基因組DNA 17.5 kbp的DNA片段 (GC含量50%) 和λ DNA 35 kbp的DNA片段。但由于GC Buffer和一般的PCR用Buffer相比DNA變性效果較強(qiáng) (特別是GC Buffer II)。因此，一般的DNA模板使用GC Buffer進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，有時(shí)會(huì)降低PCR擴(kuò)增效率。
不是，TaKaRa LA Taq 酶進(jìn)行短片段DNA擴(kuò)增時(shí)，其擴(kuò)增性能仍然很好。 如果常規(guī)PCR難以進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，可以嘗試使用TaKaRa Ex Taq 酶、TaKaRa LA Taq 酶等，有時(shí)會(huì)得到非常好的結(jié)果。
不可以。使用Pyrobest DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物3′端不附加 "A" 堿基，大部分為平滑末端。如果把使用本酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆于去磷酸的平滑末端載體時(shí)，PCR產(chǎn)物必須進(jìn)行5′末端磷酸化 (引物在合成時(shí)已進(jìn)行5′末端磷酸化除外)。
根據(jù)TaKaRa公司的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Pyrobest DNA Polymerase的PCR擴(kuò)增的可信度是通常的Taq DNA Polymerase的10倍。
根據(jù)TaKaRa公司的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用Pyrobest DNA Polymerase成功地?cái)U(kuò)增了5 kb 的人染色體DNA片段和12 kb的λ DNA片段。
需要注意以下幾個(gè)方面：
1．在配制反應(yīng)液時(shí)，請(qǐng)?jiān)诩尤雂NTP Mixture后加入Pyrobest DNA Polymerase。因?yàn)楸久傅?’→5’活性較強(qiáng)，反應(yīng)液中如果不含dNTP，引物有可能被分解。
2．使用Pyrobest DNA Polymerase擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度，會(huì)因模板DNA的種類(lèi)及擴(kuò)增的目的DNA片段的不同而各有差異。根據(jù)Takara公司的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用Pyrobest DNA Polymerase成功地?cái)U(kuò)增了5 kb的人基因組DNA片段和12 kb的λ DNA片段。
3．PCR的反應(yīng)液請(qǐng)?jiān)诒信渲?，然后置于PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。這種冷啟動(dòng)法（Cool Start Method）可增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的特異性，減少PCR過(guò)程中的非特異性反應(yīng)，能得到良好的PCR結(jié)果。
需要優(yōu)化以下幾點(diǎn)：
a）延伸時(shí)間：延伸時(shí)間>1 min./kb。
b）退火時(shí)間：設(shè)定為15 sec.。
c）退火溫度：以2℃為梯度降低退火溫度。另外，選擇3 step PCR。
d）模板DNA加量及純度：使用適合的模板DNA加量；使用高度純化的模板DNA。
e）引物濃度：在0.2～0.5 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物終濃度。
需要優(yōu)化以下幾點(diǎn)：
a) 退火時(shí)間：設(shè)定為5 sec.。
b) 退火溫度：以2℃為梯度升高退火溫度。另外，選擇2 step PCR。
c) 延伸時(shí)間：設(shè)定為1 min./kb。避免延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
d) 模板DNA：使用適合的模板DNA加量；避免使用過(guò)量的模板DNA。
e) 循環(huán)數(shù)：25-30 cycles。
f) 酶量：在推薦范圍內(nèi)減少酶量；PrimeSTAR HS加量最低為0.625 units/50 μl。
g) 引物濃度：0.2-0.3 μM (final conc.)范圍內(nèi)選擇最適濃度。
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Taq Antibody的使用方法如下：
1．將Taq DNA Polymerase和Taq Antibody等體積混合（請(qǐng)務(wù)必使用本制品原液混合）后，20-25℃下放置約10 min即可使用。
2．然后可以按照各種PCR用DNA Polymerase的常規(guī)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，Taq Antibody與TaKaRa Taq（Code No. R001）、TaKaRa Ex Taq（Code No. RR001）、TaKaRa LA Taq（Code No. RR002）都可以配合使用，實(shí)驗(yàn)效果良好。
Pfu DNA聚合酶被廣泛認(rèn)為是一種高保真酶，但PrimeSTAR系列高保真酶能夠提供比Pfu DNA聚合酶更好的保真度。在Takara Bio產(chǎn)品中，PrimeSTAR Max DNA聚合酶的保真度最高，當(dāng)該酶用于擴(kuò)增整個(gè)pUC119質(zhì)粒時(shí)，序列分析檢測(cè)到370656個(gè)堿基序列中僅有4個(gè)突變位點(diǎn)（錯(cuò)誤率為0.0010%）。此外，與其他酶相比，PrimeSTAR Max DNA聚合酶擴(kuò)增重復(fù)序列的保真度顯著提高，與相似序列的模板交換速率（形成嵌合分子）低。
考慮以下PCR酶：
1. 首選：PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 是Takara Bio產(chǎn)品中擴(kuò)增富含GC模板最有效的酶，如細(xì)菌基因組DNA。它能夠進(jìn)行高保真擴(kuò)增，錯(cuò)誤率很低。PrimeSTAR GXL DNA聚合酶已被驗(yàn)證： 能夠成功地在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中利用該酶提供的緩沖液對(duì)GC含量約為70%的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。
2. 第二選擇：對(duì)于含有高達(dá)90% GC含量的復(fù)雜模板，推薦使用Advantage GC 2 Polymerase Mix。該聚合酶適用于6 kb以下的片段的擴(kuò)增。使用該試劑盒的DMSO和GC-Melt Reagent，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR流程可擴(kuò)增大部分富含GC的序列。
3. 第三選擇：對(duì)于具有剛性結(jié)構(gòu)、用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶難以擴(kuò)增的GC-rich目的序列，推薦使用TaKaRa LA Taq DNA Polymerase with GC Buffer。首先嘗試GC buffer I，這種緩沖液有助于長(zhǎng)鏈擴(kuò)增。GC Buffer II對(duì)于具有復(fù)雜高級(jí)結(jié)構(gòu)的模板是有效的，盡管這種緩沖液對(duì)于擴(kuò)增短鏈更有效。
當(dāng)擴(kuò)增長(zhǎng)度>6 kb并且需要高保真時(shí)，推薦使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 。用該酶可以從人基因組DNA模板中擴(kuò)增出30 kb的產(chǎn)物。TaKaRa LA Taq DNA polymerase 也可以用于長(zhǎng)鏈PCR擴(kuò)增，當(dāng)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度和擴(kuò)增效率都是需要優(yōu)先考慮的因素時(shí)，推薦使用該酶。
我們有多種可用于快速反應(yīng)的PCR酶。
· 速度和保真度-PrimeSTAR Max DNA Polymerase采用特別開(kāi)發(fā)的延伸因子，Priming效率高，延伸時(shí)間可低至5秒/kb，并且退火時(shí)間僅需5秒。該酶被推薦用于克隆和表達(dá)研究。
· 高通量應(yīng)用和快速菌落PCR—SapphireAmp Fast PCR Master Mix是高通量應(yīng)用的理想選擇。該2X預(yù)混型制品包括高速DNA聚合酶、優(yōu)化的緩沖液、dNTP混合物、凝膠染料（藍(lán)色）和比重增加試劑。由于延伸時(shí)間只需要10秒/kb，高達(dá)1 kb的菌落PCR反應(yīng)可在1小時(shí)內(nèi)完成。
· SNP基因分型和快速長(zhǎng)鏈PCR--SpeedSTAR HS DNA Polymerase 擴(kuò)增效率高，可進(jìn)行延伸時(shí)間為10-20秒/kb的PCR擴(kuò)增。
TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase 和 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase對(duì)于擴(kuò)增AT-rich的目標(biāo)序列是有效的，例如含有內(nèi)含子的基因組DNA或AT-rich的線粒體DNA。我們推薦PrimeSTAR GXL DNA聚合酶用于高保真擴(kuò)增AT-rich的模板。與其他PCR酶相比，PrimeSTAR GXL DNA聚合酶可以使用標(biāo)準(zhǔn)PCR操作流程和提供的反應(yīng)緩沖液，對(duì)AT含量>60％的目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增。
注意：PrimeSTAR GXL DNA聚合酶不能用于擴(kuò)增亞硫酸氫鹽處理的DNA或其他含尿嘧啶的模板。對(duì)于這個(gè)應(yīng)用，請(qǐng)嘗試使用TaKaRa EpiTaq HS (for bisulfite-treated DNA)。
有以下幾種選擇：
· TaKaRa EpiTaq HS (for bisulfite-treated DNA)是用于亞硫酸氫鹽修飾后含有尿嘧啶的模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的理想DNA聚合酶。本制品包含Hot Start抗體，適用于甲基化分析，包括COBRA和亞硫酸氫鹽序列分析。
· EpiScope MSP Kit 是甲基化特異性PCR(MSP)分析的專(zhuān)用試劑。
· TaKaRa Taq DNA Polymerase 和TaKaRa Taq DNA Polymerase Hot Start Version這兩種PCR酶都沒(méi)有3'→5'外切酶活性，在某些情況下可以使用。
有以下幾種選擇：
TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase擴(kuò)增能力強(qiáng)，即使存在PCR抑制劑（如從植物組織粗提DNA中發(fā)現(xiàn)的多酚），也能表現(xiàn)卓越。當(dāng)PCR反應(yīng)需要保真性時(shí)，推薦使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase。雖然PrimeSTAR GXL聚合酶通常在標(biāo)準(zhǔn)操作流程下容易產(chǎn)生令人滿(mǎn)意的結(jié)果，但如果存在非常高濃度的抑制劑，將酶濃度加倍可能才會(huì)改善結(jié)果。
或者，MightyAmp™ DNA Polymerase Ver.3可以從高含量PCR抑制劑的粗樣品中直接擴(kuò)增。它可以有效地?cái)U(kuò)增多種模板，包括GC-rich 和 AT-rich的模板。該酶也可用于直接從血液樣品中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
如果這些酶都不能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，可能需要先純化模板DNA。
我們推薦使用EmeraldAmp GT PCR Master Mix。該P(yáng)CR master mix含有綠色染料和比重增加試劑，便于制備PCR反應(yīng)混合物，并可直接上樣于瓊脂糖凝膠上進(jìn)行PCR后的電泳。EmeraldAmp GT PCR Master Mix可以擴(kuò)增長(zhǎng)度高達(dá)10 kb，包括GC-rich 和 AT-rich的模板。此外，使用EmeraldAmp GT PCR Master Mix生成的PCR產(chǎn)物可以直接用于限制性?xún)?nèi)切酶消化、測(cè)序或TA克隆，無(wú)需純化。
我們推薦SapphireAmp Fast PCR Master Mix用于菌落PCR。該預(yù)混酶可以耐受大量細(xì)菌核酸的存在。制品中已含有電泳時(shí)所必需的色素試劑 (遷移速度不同的兩種藍(lán)色色素)，PCR反應(yīng)后可直接進(jìn)行電泳。
MightyAmp系列、TaKaRa Taq DNA Polymerase 和TaKaRa Taq Hot Start Version 兼容含有次黃嘌呤的引物。
含有次黃嘌呤的引物不能與具有3'→5'外切酶活性的PCR酶搭配使用（例如PrimeSTAR HS DNA Polymerase, PrimeSTAR Max DNA Polymerase, PrimeSTAR GXL DNA Polymerase, TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase, or TaKaRa LA Taq DNA polymerases。當(dāng)使用其中一款適用的PCR酶做簡(jiǎn)并PCR時(shí)，我們建議在有需求的位置使用A、T、G或C混合的簡(jiǎn)并引物，而不是含有次黃嘌呤的引物。
想要獲得高靈敏度檢測(cè)，我們推薦使用Titanium Taq DNA Polymerase 或者TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase 。這兩種聚合酶已成功地應(yīng)用于高靈敏度基因分型。
我們推薦使用MightyAmp™ DNA Polymerase Ver.3從粗提物或直接從組織中擴(kuò)增靶位點(diǎn)。下面列出了直接PCR應(yīng)使用的各種組織的推薦量：
· EDTA 抗凝血，肝素抗凝血 ≤10 μl
· 檸檬酸抗凝血≤5 μl
· 小鼠尾 ≤1 mm
· 小鼠耳 ≤1.5 mm2
· 小鼠臟器、腦 ≤1.5 mm3
· 植物葉片（西紅柿、擬南芥、菠菜） ≤直徑 2 mm
· 生體樣品粗提液 ≤5 μl
我們推薦TaKaRa Taq DNA Polymerase 或 Titanium Taq DNA Polymerase 用于多重PCR。有關(guān)使用Titanium Taq DNA Polymerase進(jìn)行高通量基因分型的多重PCR的更多信息，請(qǐng)參閱產(chǎn)品網(wǎng)頁(yè)下方的tech note。
· PrimeSTAR系列PCR酶
這個(gè)系列的酶具有較強(qiáng)的3'→5'外切酶活性，擴(kuò)增產(chǎn)物大部分都為平滑末端，不能直接進(jìn)行TA克隆。PrimeSTAR系列DNA聚合酶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆時(shí)，3’端必須添加“A”堿基。我們推薦使用Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR®，可簡(jiǎn)單地對(duì)PrimeSTAR系列DNA聚合酶的PCR產(chǎn)物3’端添加“A”堿基。A-overhang mixture與MightyTA-cloning Kit 配套使用，是PrimeSTAR系列DNA聚合酶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的TA克隆專(zhuān)用試劑。
· Taq 和MightyAmp系列PCR酶
TaKaRa Taq, TaKaRa Ex Taq, TaKaRa LA Taq, SpeedSTAR HS, EmeraldAmp, SapphireAmp Fast, and MightyAmp系列PCR酶擴(kuò)增得到的大部分PCR產(chǎn)物3’端附有一個(gè)“A” 堿基，因此可直接克隆于T-Vector中。也可以在末端平滑化和磷酸化后克隆到平滑末端載體。
· 所有Takara Bio DNA聚合酶
使用特定聚合酶擴(kuò)增后的片段末端結(jié)構(gòu)見(jiàn)下表。一些聚合酶產(chǎn)生平末端和A-overhang產(chǎn)物的混合物；另一些聚合酶僅產(chǎn)生平末端或A-overhang產(chǎn)物。
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頁(yè)面更新：2020-04-23 14:00:41
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