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| 注意：購買以上產(chǎn)品，需要填寫專利確認(rèn)書 |
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| CRISPR/Cas9質(zhì)粒系統(tǒng) |
| 對于使用CRISPR/Cas9 技術(shù)進(jìn)行哺乳動物基因組編輯來說，Guide-it CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是可以用于克隆和表達(dá)靶向單鏈向?qū)NA (single guide RNAs, sgRNAs)的試劑盒。該系統(tǒng)中的載體同時表達(dá)Cas9核酸酶、針對特定位點的sgRNA和明亮的熒光蛋白質(zhì)。其中兩種熒光蛋白質(zhì)（ZsGreen1 和 tdTomato）可供選擇，用于監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率或在后期使用流式細(xì)胞儀富集/分選轉(zhuǎn)染細(xì)胞時用到。使用該系統(tǒng)構(gòu)建一個表達(dá)特異性序列的sgRNA的質(zhì)粒非常簡單；將用戶提供的、與目標(biāo)序列對應(yīng)的兩條核酸單鏈退火結(jié)合成為雙鏈，再使用系統(tǒng)中包含的高效率連接混合液將雙鏈插入到線性化的質(zhì)粒中。這個試劑盒同樣包括Stellar感受態(tài)細(xì)胞，確保高效率的轉(zhuǎn)化。 |
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| 產(chǎn)品特點： |
· 單質(zhì)粒載體：特異性靶向sgRNA的表達(dá)由人的U6啟動子驅(qū)動，Cas9核酸酶及明亮的熒光標(biāo)志(ZsGreen1 或 tdTomato)的表達(dá)由一個雙向CMV啟動子驅(qū)動。
· 熒光蛋白質(zhì)tdTomato和ZsGreen1異常明亮：分別是EGFP亮度的6倍和2.5倍；這些標(biāo)志物可以被用于監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率、或使用流式細(xì)胞儀富集/分選轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
· 簡便地構(gòu)建質(zhì)粒：針對您的靶序列設(shè)計的特異性寡核苷酸，然后使用試劑盒中提供的高效率混合液和高效的感受態(tài)細(xì)胞克隆到預(yù)先線性化的質(zhì)粒中。
· 包含足夠的試劑：足夠用于構(gòu)建表達(dá)10種不同的sgRNA的質(zhì)粒。
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| 產(chǎn)品應(yīng)用： |
| 使用CRISPR/Cas9技術(shù)對哺乳動物進(jìn)行基因編輯時，靶向單鏈向?qū)NA（sgRNA）的克隆和表達(dá)。 |
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| 產(chǎn)品組份： |
Guide-it CRISPR/Cas9 System (Green) (Code No. 632601)
· pGuide-it-ZsGreen1 Vector (Linear)
· Guide-it Ligation Components
· Stellar Competent Cells
Guide-it CRISPR/Cas9 System (Red) (Code No. 632602)
· pGuide-it-tdTomato Vector (Linear)
· Guide-it Ligation Components
· Stellar Competent Cells
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| 實驗例： |
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分別接種1×105個HEK293、HeLa、U2OS、HT1080細(xì)胞至12孔板，培養(yǎng)16 h后，采用Xfect Transfection Reagent轉(zhuǎn)染2.5 μg pGuide-it-ZsGreen1質(zhì)粒至細(xì)胞。pGuide-it-ZsGreen1質(zhì)粒包含分別以CCR5、C4BPB、EMX1為靶基因設(shè)計的sgRNA。
轉(zhuǎn)染48 h后，通過熒光顯微鏡觀察ZsGreen1熒光表達(dá)情況（A），通過FACS測定轉(zhuǎn)染效率（B. Transfection%）。
采用Guide-it Mutation Detection Kit測定基因突變導(dǎo)入效率。以細(xì)胞為起始直接PCR擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過變性及退火后產(chǎn)生錯配位點，之后Guide-it解離酶剪切錯配位點。剪切產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳后，通過密度分析測定基因突變導(dǎo)入效率（B. Indel%）。
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| （數(shù)據(jù)來源于Takara Bio USA, Inc.） |
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京公網(wǎng)安備 110114000405號
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